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有机磷农药的胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制

作　者: 刘莹
导　师: 魏新林
学　校: 上海师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 有机磷农药残留检测胶体金免疫层析试纸条
分类号: R155
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

有机磷农药目前仍在世界范围内广泛使用,其检出率高、超标严重、毒性大,对消费者的身体健康造成了极大的危害。加大有机磷农药的监控力度,开发快速检测技术成为有机磷农药残留检测的研究趋势,是事关国计民生的重大食品安全问题。本研究基于免疫分析原理,利用胶体金标记技术,研制了一种胶体金免疫层析试纸条,为有机磷农药的现场监控提供了可能,并为农药小分子的胶体金免疫层析试纸条的制作提供了理论依据。本实验的主要研究内容和结果如下:1通过重氮化法合成了一种有机磷人工抗原。先将合成的有机磷半抗原产物通过质谱分析和核磁共振鉴定,确定半抗原合成成功。偶联后的全抗原经紫外扫描和红外光谱鉴定,确定半抗原与载体蛋白偶联成功。经浓度测定,有机磷人工抗原产物的蛋白含量为4.32mg/ml。通过紫外吸收法测得半抗原和载体蛋白的偶联比为7.61:1。2制备了有机磷单克隆抗体胶体金标记探针,确定胶体金标记的最佳pH为8.0,最适蛋白量为24μg/ml。通过斑点金免疫渗滤实验和免疫层析实验,鉴定制备的金标抗体探针具有免疫活性。3以有机磷人工合成抗原为包被抗原固定于硝酸纤维素膜的检测线位置,以羊抗鼠IgG包被于硝酸纤维素膜的控制线位置,组装了胶体金免疫层析试纸条。对试纸条的各个组分进行了研究,确定了硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫等膜材料的使用型号,对各种膜的浸泡处理液的配方进行了优化选择,对免疫层析反应的溶液系统进行了筛选,并对包被抗原、羊抗鼠二抗及金标抗体的浓度和喷量进行了调试和确定。最后对制备的胶体金试纸条进行了灵敏度、特异性、稳定性和重复性等各项质量性能指标测试。结果表明,该胶体金试纸条可检出杀螟硫磷、甲基对硫磷、对硫磷等9种有机磷农药,最低检出浓度可达0.25 mg/kg,可用于多种有机磷农药的初筛。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-5
主要符号表  5-6
目录  6-11
第一章绪论  11-21
  1 农药残留与食品安全  11
  2 有机磷农药概况  11-14
    2.1 有机磷农药的理化性质及毒性  11-12
    2.2 有机磷农药使用概况及残留危害  12-14
  3 有机磷农药快速检测技术研究现状  14-18
    3.1 化学法  14
    3.2 胆碱酯酶抑制法  14-15
    3.3 发光菌检测法  15
    3.4 化学发光技术  15-16
    3.5 生物传感技术  16
    3.6 生物芯片技术  16
    3.7 免疫分析法  16-18
  4 胶体金免疫层析技术在农药残留检测中的应用及发展趋势  18-21
    4.1 胶体金免疫层析技术  18
    4.2 胶体金免疫层析技术在农药残留检测中的应用  18-19
    4.3 胶体金免疫层析技术的发展趋势  19-21
第二章有机磷人工完全抗原的合成与鉴定  21-33
  1 前言  21
  2 试剂与仪器  21-22
    2.1 试剂  21
    2.2 材料与仪器  21-22
  3 方法  22-25
    3.1 有机磷人工抗原的制备  22-23
    3.2 有机磷半抗原产物的鉴定  23
    3.3 有机磷人工抗原产物的质量评定  23-25
  4 结果与分析  25-33
    4.1 有机磷半抗原产物的鉴定结果及分析  26-29
    4.2 有机磷人工抗原产物的质量评定  29-33
第三章胶体金的制备及有机磷金标抗体探针的研制  33-46
  1 前言  33
  2 试剂与仪器  33-34
    2.1 试剂  33
    2.2 材料与仪器  33-34
  3 方法  34-38
    3.1 胶体金的制备  34-35
    3.2 胶体金的质量评定  35
    3.3 可见光光谱法评价胶体金制备因素影响  35
    3.4 透射电镜与可见光光谱分别评价胶体金质量结果的比较  35
    3.5 胶体金粒径与柠檬酸三钠添加量及最大吸收波长的关系  35-36
    3.6 有机磷金标抗体探针的制备  36-38
  4 结果与分析  38-46
    4.1 胶体金质量鉴定结果  38-39
    4.2 可见光光谱法评价胶体金制备因素影响  39-41
    4.3 透射电镜与可见光光谱分别评价胶体金质量结果的比较  41-42
    4.4 胶体金粒径与柠檬酸三钠添加量及最大吸收波长的关系  42-43
    4.5 胶体金标记抗体蛋白  43-46
第四章有机磷胶体金免疫层析试纸条的研制  46-61
  1 前言  46
  2 试剂与仪器  46-47
    2.1 试剂  46
    2.2 材料与仪器  46-47
  3 方法  47-51
    3.1 有机磷金标抗体稀释液及工作浓度范围的确定  47
    3.2 有机磷包被抗原工作液及工作浓度范围的确定  47
    3.3 羊抗鼠二抗工作液及工作浓度范围的确定  47-48
    3.4 金标垫膜材料与浸泡处理液的筛选  48
    3.5 样品垫膜材料与浸泡处理液的筛选  48
    3.6 硝酸纤维素膜(NC膜)的筛选  48
    3.7 金标抗体、包被抗原、羊抗鼠二抗喷涂量的选择  48-49
    3.8 试纸条T/C线的调试  49
    3.9 试纸条的质量性能指标测试  49-50
    3.10 试纸条测定结果的影响因素  50-51
    3.11 试纸条的半定量检测  51
  4 结果与分析  51-61
    4.1 胶体金免疫层析试纸条的组成  51
    4.2 胶体金免疫层析试纸条检测有机磷农药残留的原理  51-52
    4.3 有机磷金标抗体稀释液及工作浓度范围的确定  52-53
    4.4 有机磷包被抗原工作液及工作浓度范围的确定  53
    4.5 羊抗鼠二抗工作液及工作浓度范围的确定  53-55
    4.6 金标垫膜材料与浸泡处理液的筛选  55
    4.7 样品垫膜材料与浸泡处理液的筛选  55-56
    4.8 硝酸纤维素膜(NC膜)的筛选  56
    4.9 金标抗体、包被抗原、羊抗鼠二抗喷涂量的选择  56-58
    4.10 试纸条T/C线终调试结果  58
    4.11 试纸条的性能指标测试结果  58-59
    4.12 有机溶剂对试纸条测定结果的影响  59
    4.13 盐离子浓度对试纸条测定结果的影响  59-60
    4.14 包被液中添加表面活性剂对试纸条测定结果的影响  60
    4.15 试纸条的半定量测定结果  60-61
第五章结论与展望  61-62
致谢  62-63
参考文献  63-71

有机磷农药的胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制

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