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BN-PAGE分析油菜种子蛋白差异体系的建立

作　者: 蔡家海
导　师: 刘春林
学　校: 湖南农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 油菜种子油体蛋白体 BN-PAGE
分类号: S565.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

油菜作为世界范围内主要的油料作物,其油主要食用,其饼粕主要饲用。近年来人们对油菜的品质不断改良并且菜籽油也大量应用于化工,能源领域。转基因油菜也用来生产可降解塑料的原油和生产昂贵的多肽、蛋白等药物,由于菜籽油用途的不断拓展,对其研究也不断深入。我国对油的需求巨大,而供给能力严重不足。年消耗食用植物油2000万吨,进口1000万吨,已是世界上最大的油料进口国,13亿人口大国高度依赖进口油,隐含着食品和能源保障上的重大安全隐患。因此采用科学方法来改良我国油菜品质,提高油菜籽含油量已迫在眉睫。对于油菜脂肪酸的研究,在分子水平上一是通过在基因组学的研究基础上揭示油菜籽油脂形成的分子机理,一是在蛋白水平上来揭示油菜籽油脂形成的分子机理。对于蛋白质的分析,首先我们要获得目的蛋白,这可以通过电泳来实现。以等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)为第一向的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)是目前最常用来分离蛋白质的技术。但是一些分子质量较大的蛋白质(200KD),偏酸偏碱的蛋白质以及疏水性较强的膜蛋白质的分离,采用2D—PAGE往往不能得到理想的结果。在BN-PAGE中用一些温和的去污剂如dodecylmaltoside(DM)、TritonX-100和毛地黄皂苷(digitonin)等,增溶膜蛋白复合物,从而使复合物以近似天然的形态分离。由于BN-PAGE技术在增溶膜上蛋白体方面的优势,所以我们采用此技术,以便可以更好的了解油体蛋白体与油脂合成的关系。为进一步了解油体蛋白体的功能对油菜发育和脂肪酸合成的作用,在分子水平来研究油菜脂肪酸合成的分子机理,提高油菜含油量打下基础。通过实验结果可知,我们电泳出了不同油菜品种间,同一时期油体蛋白体差异点,其中有8个在湘油15上是特有斑点,在HOO1上没有斑点;有5个在HOO1上是特有斑点,在湘油15上没有斑点。证明此体系可以用来分析油体膜蛋白体。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章文献综述  9-19
  1 BN胶  9-12
    1.1 BN-PAGE电泳分离的原理  9
    1.2 样品的制备  9-10
      1.2.1 膜样品的增溶  10
      1.2.2 制备可溶性复合物  10
    1.3 BN分离的分辨率  10
    1.4 BN与其它胶结合  10-12
      1.4.1 BN胶的第二和第三向电泳  10-11
      1.4.2 BN/SDS-PAGE  11
      1.4.3 BN/BN-PAGE  11
      1.4.4 BN/IEF/Tricine-SDS-PAGE  11-12
    1.5 BN胶染料  12
    1.6 BN胶的免疫印迹  12
    1.7 鉴定蛋白复合物  12
  2 BN-PAGE的局限性  12-13
    2.1 去污剂  12
    2.2 分辨率  12-13
  3 BN技术的应用  13
    3.1 BN技术在植物中的应用  13
    3.2 在细菌、酵母、和哺乳动物中的应用  13
  4 蛋白质组研究进展  13-17
    4.1 蛋白质组学研究的研究意义和背景  13-15
    4.2 蛋白质组学研究的策略和范围  15
    4.3 蛋白质组学研究技术  15-17
      4.3.1 蛋白质组研究中的样品制备  15-16
      4.3.2 蛋白质组研究中的样品分离和分析  16
      4.3.3 蛋白质组研究的新技术  16
      4.3.4 蛋白质组生物信息学  16-17
      4.3.5 蛋白质组学发展趋势  17
  5 本实验的目的和意义  17-19
第二章油菜种子油体膜蛋白体的提取与分离  19-23
  1 材料与方法  19-20
    1.1 材料  19
    1.2 方法  19-20
      1.2.1 种子的选择及种粒的剥离  19
      1.2.2 油菜种子油体膜蛋白体的提取方法  19-20
    1.3 仪器与试剂  20
  2 采用BRADFORD法测定所得样品的蛋白浓度  20-23
    2.1 溶液的配置  20
    2.2 标准曲线的制作  20-21
    2.3 样品蛋白浓度检测  21-23
第三章 BN-PAGE电泳技术体系的建立  23-33
  1 材料与方法  23-31
    1.1 材料  23
    1.2 分子生物学试剂与仪器  23
    1.3 溶液的配制  23-25
    1.4 第一向电泳BN-PAGE  25-26
      1.4.1 配制5%—20%的梯度分离胶,4%的浓缩胶,4℃保存过夜,第二天进行电泳  25
      1.4.2 BN-PAGE胶的制备及电泳  25-26
    1.5 第二向SDS-PAGE电泳  26-28
      1.5.1 配制10%的梯度分离胶,5%的浓缩胶  26-27
      1.5.2 凝胶的制作:  27
      1.5.3 凝胶板的制备  27
      1.5.4 样品的处理与加样  27-28
    1.6 方法  28-29
      1.6.1 油体蛋白体的的增溶  28
      1.6.2 电泳  28
      1.6.3 凝胶板剥离与固定  28
      1.6.4 染色与脱色  28-29
    1.7 第一向BN-PAGE电泳结果  29-30
    1.8 SDS-PAGE第二项的电泳结果  30-31
  2 讨论  31-33
参考文献  33-36
致谢  36-37
作者简介  37

BN-PAGE分析油菜种子蛋白差异体系的建立

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