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糖化酶工业生产菌株选育及其种子制备工艺优化

作　者: 宋毅
导　师: 王正祥
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 糖化酶工业菌株筛选方法离子束诱变液体培养方法菌丝体形态
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

糖化酶,全名葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase EC.3.2.1.3),是水解淀粉的主要酶类,广泛应用于食品、医药、发酵等工业。作为我国酶制剂中的支柱产品,糖化酶产品已成为酶制剂产品中产量最大的品种,出口亦达到较大的数量,但是当前的问题是产品售价已降至接近制造成本,企业获利甚微。因此,进一步选育糖化酶高产菌株,缩短发酵生产周期,降低生产成本,对糖化酶的工业生产仍然具有十分重要的意义。本文以获得高糖化酶活性菌株为目标,通过对实验室保藏的糖化酶工业生产菌株黑曲霉CICIM GAH14进行多次低能N+离子束诱变,最终筛选出了一株糖化酶高产菌株38-3,其糖化酶产酶水平较出发菌株高出31.7%。经过5代遗传稳定性实验结果表明,连续传5代,38-3菌株产酶活力维持稳定,具有良好的遗传稳定性。本研究中,建立了一种以潮霉素抗性为检测指标的新的诱变育种初筛方法,以之为初筛手段,经过多轮复筛及传代验证筛选得到了38-3菌株,证明该方法是一种行之有效的新方法。为了提高糖化酶工业生产菌种的研究和应用效率,针对丝状真菌形态变化对产酶的影响,本文以糖化酶工业生产菌株黑曲霉GB0506为出发菌株,在该菌原始培养流程的基础上对其活化培养基配方及种子液体培养方法进行了改良。实验结果表明,在固体活化培养基中添加0.2%的酵母粉及1%的玉米淀粉,有利于在保持原有酶活力的基础上加速菌体生长;加入40粒,粒径3～4mm的玻璃珠130r/min,摇床培养可以获得更为分散、均一利于发酵的种子液;液体种子制备的较优条件为初始pH5.8,装液量60mL,琼脂加量0.1%,培养天数5d。由此,糖化酶种子制备时间较现在工业生产上使用的工艺缩短了4d,进行的后续糖化酶摇瓶发酵产酶水平最高时是原工艺的1.18倍。此改良后的方法应用于诱变菌株的摇瓶筛选,同样得到了相当稳定的发酵结果,并显著缩短了诱变菌株的筛选周期。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
第一章绪论  7-14
  1.1 糖化酶简介  7-11
    1.1.1 糖化酶的特性及研究进展  7-8
    1.1.2 糖化酶高产菌株的选育  8-9
    1.1.3 菌体形态变化对发酵产酶的影响  9-10
    1.1.4 糖化酶生产菌的快速筛选策略  10-11
  1.2 离子束工程简介  11-12
    1.2.1 离子束工程概述  11-12
    1.2.2 离子束工程研究进展  12
  1.3 本论文的立题意义及主要研究内容  12-14
第二章材料与方法  14-18
  2.1 菌株  14
  2.2 主要试剂  14
  2.3 主要仪器  14
  2.4 培养基和培养条件  14-15
  2.5 诱变方法  15-16
    2.5.1 菌种活化  15
    2.5.2 生长曲线绘制方法  15
    2.5.3 保护剂添加方法  15
    2.5.4 潮霉素抗性敏感性的确定  15
    2.5.5 离子束诱变出发菌悬液的制备  15
    2.5.6 离子束诱变  15-16
  2.6 筛选方法  16
    2.6.1 初筛方法  16
    2.6.2 复筛方法  16
    2.6.3 酶活测定方法  16
  2.7 原生质体制备  16
  2.8 遗传稳定性实验  16
  2.9 液体菌种制备优化实验  16-18
    2.9.1 活化培养基选择  16
    2.9.2 摇床培养方法优化  16-17
    2.9.3 正交试验设计  17
    2.9.4 生物量测定方法  17-18
第三章结果  18-34
  3.1 GB0506 离子束诱变  18-24
    3.1.1 出发菌株菌龄的选择  18
    3.1.2 不同打散方式对菌丝体打散效果的比较  18-20
    3.1.3 保护剂的添加对离子束注入黑曲霉菌丝体的影响  20-22
    3.1.4 不同剂量低能 N~+注入 GB0506 致死率曲线  22
    3.1.5 4%淀粉平板筛选效果  22-23
    3.1.6 摇瓶筛选结果  23-24
  3.2 GAH14离子束诱变  24-30
    3.2.1 潮霉素抗性菌株PCR验证结果  24
    3.2.2 不同转化子潮霉素敏抗性感性  24-25
    3.2.3 潮霉素抗性平板初筛效果  25
    3.2.4 摇瓶复筛结果  25-26
    3.2.5 高酶活诱变子原生质体纯化  26-27
    3.2.6 传代稳定性研究  27-28
    3.2.7 GAY12潮霉素抗性敏感性  28
    3.2.8 GAY12诱变子抗性平板初筛  28-29
    3.2.9 GAY12诱变子摇瓶复筛结果  29
    3.2.10 GAY12传代稳定性研究  29
    3.2.11 突变株38-3的突变谱系  29-30
  3.3 液体种子制备优化结果  30-34
    3.3.1 不同活化培养基对菌体生长及发酵产酶的影响  30-31
    3.3.2 不同打散方式对菌体生长及发酵产酶的影响  31-32
    3.3.3 正交试验结果  32-33
    3.3.4 正交验证试验  33-34
第四章讨论  34-36
论文主要结论  36-37
致谢  37-38
参考文献  38-42
附录  42

糖化酶工业生产菌株选育及其种子制备工艺优化

内容摘要

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