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高糖对人肾小球系膜细胞mTOR信号通路的影响及白藜芦醇的干预作用

作　者: 刘霞
导　师: 汤旭磊
学　校: 兰州大学
专　业: 内分泌与代谢病
关键词: 高糖人肾小球系膜细胞 mTOR信号通路雷帕霉素白藜芦醇系膜细胞增殖系膜细胞肥大细胞外基质积聚
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的观察高糖对人肾小球系膜细胞增殖、细胞外基质分泌的影响,及雷帕霉素、白藜芦醇的干预作用,并探讨其机制。方法取对数生长期的系膜细胞,消化后用5%胎牛血清的DMEM低糖培养液调细胞密度至每次实验所需的细胞密度,放入孵箱37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。待细胞贴壁换用无血清的培养液孵育24h后,吸出无血清培养液按以下实验目的加入含不同药物浓度的培养液。(1)观察雷帕霉素对高糖培养人肾小球系膜细胞的影响,将HMC随机分为：正常对照组(NG组,葡萄糖浓度5.6mmol/L),高糖组(HG组,葡萄糖浓度30mmol/L),雷帕霉素组(Rap组,葡萄糖浓度5.6mmol/L+雷帕霉素40nmol/L),高糖+雷帕霉素组(HG+Rap组,葡萄糖浓度30mmol/L+不同浓度雷帕霉素),分别为HG+Rap1组(Rap10nmol/L)、HG+Rap2组(Rap20nmol/L)及HG+Rap3组(Rap40nmol/L)。各组细胞培养12、24、48h用MTT法检测细胞增殖；培养48h收集各组细胞及上清液用RT-PCR法检测细胞内mTOR、P70S6K的表达,检测上清液中转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)的含量。(2)观察白藜芦醇对高糖培养人肾小球系膜细胞的影响,将HMC随机分为：NG组,HG组,白藜芦醇组(Res组,葡萄糖浓度5.6mmol/L+白藜芦醇104mol/L),高糖+白藜芦醇组(HG+Res组,葡萄糖浓度30mmol/L+不同浓度白藜芦醇),分别为HG+Res1组(Res10-6mol/L)、HG+Res2组(Res10-5mol/L)及HG+Res3组(Res104mol/L)。各组细胞培养12、24、48h用MTT法检测细胞增殖；检测48h细胞上清液中转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)、超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及总抗氧化能力(TAC)的含量。提取NG组、HG组、Res组及HG+Res3组48h细胞的RNA,用RT-PCR法检测细胞内mTOR、P70S6K的表达。结果1.与同组12h比较,NG组随时间延长OD值呈增加趋势,但无统计学意义,HG组随时间延长OD值明显增加(P<0.01),Rap组和Res组OD值无明显变化,HG+Rap各组和HG+Res各组随时间延长仍明显增殖(P<0.01)。在同一时间点,与NG组相比,高糖可以促进HMC增殖,HG组OD值明显增加(P<0.01),Rap组和Res组OD值与NG组相近。与同时间HG组比较,HG+Rap和HG+Res各组明显抑制系膜细胞增殖,且随浓度增加对系膜细胞的抑制能力增强,OD值明显减低(P<0.05,P<0.01),但仍高于NG组。2.48h HG组比NG组TGF-β1、Col-Ⅳ浓度明显增加(P<0.01),Rap组和Res组较NG组TGF-β1、Col-Ⅳ水平无明显变化。HG+Rap和HG+Res各组均能抑制TGF-β1、Col-Ⅳ的表达(P<0.05,P<0.01),且具有浓度依赖性。3.HG组较NG组SOD活性和TAC能力明显降低(P<0.01),MDA产生增加(P<0.01)。Res组较NG组SOD活性、TAC能力及MDA含量差异无显著性。HG+Res各组随浓度增加较HG组SOD活性,TAC能力增加(P<0.05,P<0.01),且具有浓度依赖性,MDA含量减少(P<0.01)。4.与NG组比较,HG组上调mTOR、P70S6K的表达,HG+Rap各组和HG+Res3组能不同程度的下调两者表达(P<0.05,P<0.01)。结论1.高糖在体外促进了人肾小球系膜细胞的增殖、增加了细胞因子TGF-β1及细胞外基质Col-Ⅳ的分泌,诱导了系膜细胞的氧化应激,并且使mTOR、P70S6K表达活性增强。2.雷帕霉素通过下调mTOR、P70S6K的表达,抑制了系膜细胞的增殖、减少了细胞因子TGF-β1及细胞外基质Col-Ⅳ的分泌。3.白藜芦醇抑制了系膜细胞的增殖、减少了细胞因子TGF-β1及细胞外基质Col-Ⅳ的分泌,其除与改善系膜细胞的氧化应激有关外,还可能与白藜芦醇下调mTOR、P70S6K的表达有关。

高糖对人肾小球系膜细胞mTOR信号通路的影响及白藜芦醇的干预作用

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