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快速PCR方法的建立及其在牛精子和胚胎性别鉴定中的应用

作　者: 林博
导　师: 王栋
学　校: 中国农业科学院
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 两温度梯度PCR 优化牛精子胚胎性别鉴定
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 202次
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内容摘要

产奶、产蛋等性状是限性性状,生长发育等性状的表达因性别不同而呈现较大差异,所以性别控制技术研究在畜牧经济生产中具有重要意义。目前,根据X、Y精子DNA含量不同而进行的精子分离技术是重复性最好、最为科学有效的分离方法,但对于分离效果的评价体系尚未健全;同时,胚胎性别鉴定作为性别控制的另一种形式,已经发展了很多技术方法,在这些方法中,PCR技术以其稳健的检测结果和简便的技术操作而备受关注。然而,以往的PCR方法大都是针对仅存在于Y染色体上的Sry基因进行检测分析,需要通过双重PCR方法、巢式PCR方法等进行检测分析,不但检测方法繁琐、操作的技术要求较高,而且PCR扩增及后续的检测分析需要较长的时间,增加了胚胎体外应激的时间,因此,有必要对PCR方法的各个环节进行深入研究,以建立简便、快捷、高效、低成本的实用PCR胚胎性别鉴定技术,并针对X、Y精子分离技术建立相应的科学、高效评价技术体系。常规PCR温度循环程序通常包括变性、退火、延伸三个温度梯度,但研究表明延伸温度梯度的存在与否及存在时间与所扩增片段的长度有直接关系,当扩增片段较小时,就可以由三个温度梯度变为两温度梯度,这样可以使扩增时程大大缩短,如能挖掘出两温度梯度PCR的扩增潜能并对其进行优化,则PCR方法就可实现其快速、简便、成本低的技术特点,并在生物等诸多领域具有更广泛的应用前景。基于此,本研究采用两温度梯度PCR方法进行了大于200bp片段的扩增研究,并对牛血液、精子、毛囊DNA等多种模板进行了检测分析,成功进行了长度为207 bp到1413 bp的PCR扩增,但对1561 bp长度片段却未能成功扩增。对1561bp片段扩增条件的研究表明,适当延长变性和退火时间,可以相应减少三温度梯度PCR的延伸时间,其原因还有待于进行深入探讨。对两温度梯度PCR扩增效率影响因素的优化表明,当镁离子浓度为1.0 mM,聚合酶为1.0个单位,循环数为30时,所建立的两温度梯度PCR方法能达到最佳的扩增效果,并且,不同仪器和不同Taq酶对两温度梯度PCR效果影响的研究结果表明,利用两温度梯度PCR,通过普通仪器和普通Taq酶即可实现长度在1413bp以下片段的有效扩增,据此推断,PCR方法的最长片段扩增能力主要取决于Taq酶本身的动力学活性,而不是主要取决于所使用的仪器和所使用的试剂。对牛血液和成纤维细胞的双重PCR扩增结果表明,两温度梯度PCR不但适用于简单PCR扩增,也适合于双重PCR等复杂扩增检测研究,而且还可以应用于牛性别鉴定等特别的检测分析领域。与普通PCR相比,快速PCR可将扩增时间由原来的1.5 ~ 2.0小时缩短到25 ~ 35分钟,即一次扩增所用的时间还不到原来的一半。性别鉴定引物的模板特点决定了所采用的PCR扩增方法的类型。本研究一改以往针对仅存在于Y染色体上的性别特异序列进行性别鉴定的策略,通过对X和Y染色体上不同多态特点的牙釉基因的等位基因(AML)进行序列比对分析,设计了一对性别特异引物,并通过对牛血液、精液DNA模板进行PCR扩增验证了该引物的有效性后,采用该引物对从常规精液、分离的X-精液和Y-精液中各分离出来的100个单精子进行了快速PCR性别鉴定,所检测的单精子模板均获得了清晰可辨的特异产物条带,对所检测的常规精液、分离的X精液和Y精液中的X精子和Y精子比例进行了统计推断,统计结果表明,常规冷冻精液中X、Y精子比率为1:1,分离的X-精液中X精子比率为84.0%,分离的Y-精液中Y精子比率为88.0%,各类精液的统计结果与理论比值(常规精液)和重分离分析结果(性控精液)没有显著差异,表明快速PCR可以用于牛精子的性别鉴定,并且可以进行分离精子的纯度分析,自此,本研究室建立了一种简单易行、成本低廉、可靠性高的性控精液纯度快速检测分析方法,使性控精液的纯度分析摆脱了对流式细胞仪等专有大型设备的依赖,成为可在一般实验室中进行检测分析的常规方法,为进行更深入的精子分离研究奠定了技术基础,也为性控精液的推广应用提供了强有力的技术支撑。本研究还将所建立的简单快速PCR检测体系进行胚胎性别鉴定研究。首先利用快速PCR方法对牛成纤维细胞进行了检测分析,并以双重PCR方法作为阳性对照,研究结果表明,该体系可以对成纤维细胞进行准确的性别鉴定检测分析,在以双重PCR方法作为阳性对照的胚胎性别鉴定研究中,该简单PCR方法取得了较为理想的扩增检测结果,并从双重PCR方法的对照中得到了验证,将该反应体系进行优化并设计出了简单有效的试剂盒,简化了实验操作,以使其更方便于现场检测分析。对试剂盒的检测分析表明,该试剂盒有助于节省生产成本、提高生产效率,在牛性别鉴定和性别控制中具有巨大的生产意义,该检测方法的建立在法医鉴定中也有较高的应用价值。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章文献综述  13-20
  1.1 性别控制的必要性及研究进展  13-15
    1.1.1 性别控制的必要性  13
    1.1.2 性别控制技术的研究进展  13-15
  1.2 PCR 技术方法的类型及引物设计  15-18
    1.2.1 常规PCR 与多重PCR  15-16
    1.2.2 巢式PCR  16-17
    1.2.3 两温度梯度PCR  17
    1.2.4 PCR 引物设计  17-18
  1.3 PCR 技术应用前景与展望  18
  1.4 本项目立题的目的和意义  18-20
第二章两温度梯度快速PCR 方法的探索及优化  20-31
  2.1 引言  20
  2.2 试验材料  20-22
    2.2.1 血液、精液和毛囊的采集  20
    2.2.2 主要仪器设备  20-21
    2.2.3 主要试剂和酶  21-22
  2.3 试验方法  22-24
    2.3.1 主要试剂的配制  22
    2.3.2 血液、毛囊、精子DNA 模板的制备  22-23
    2.3.3 引物的设计与合成  23
    2.3.4 PCR 扩增程序  23-24
    2.3.5 琼脂糖凝胶电泳检测  24
  2.4 实验结果与分析  24-29
    2.4.1 两温度梯度PCR 方法扩增能力的探索  24-26
    2.4.2 两温度梯度PCR 反应体系的优化  26-28
    2.4.3 不同聚合酶和实验仪器对两温度梯度PCR 的影响  28-29
    2.4.4 两温度梯度快速PCR 在牛性别鉴定中的有效性检验  29
  2.5 讨论  29-31
第三章利用单精子快速PCR 检测牛X、Y 精液的纯度  31-43
  3.1 引言  31
  3.2 实验材料  31-32
    3.2.1 血液、精液的采集  31-32
    3.2.2 仪器设备  32
    3.2.3 试剂和酶  32
  3.3 试验方法  32-36
    3.3.1 主要试剂的配制  32
    3.3.2 引物设计  32-33
    3.3.3 血液DNA 模板的PCR 性别鉴定分析  33-34
    3.3.4 性控精液或常规冷冻精液的洗涤  34
    3.3.5 大量精子DNA 模板的制备及PCR 反应  34-36
    3.3.6 琼脂糖凝胶电泳检测  36
  3.4 实验结果与分析  36-41
    3.4.1 牛血液基因组DNA 和常规冷冻精液PCR 扩增结果  36-37
    3.4.2 牛和人血液基因组DNA 模板的扩增结果  37
    3.4.3 常规精液的单精子快速PCR 扩增结果  37-38
    3.4.4 性控精液X-精子的单精子快速PCR 扩增结果  38-39
    3.4.5 性控精液Y-精子的单精子快速PCR 扩增结果  39-41
  3.5 讨论  41-43
第四章成纤维细胞和胚胎细胞的快速PCR 性别鉴定  43-50
  4.1 引言  43
  4.2 实验材料  43-44
    4.2.1 成纤维细胞的获取和DNA 模板的制备  43-44
    4.2.2 胚胎细胞的获取和DNA 模板的制备  44
    4.2.3 试剂盒的制备  44
    4.2.4 引物设计  44
  4.3 试验方法  44-45
    4.3.1 成纤维细胞的 PCR 反应  44-45
    4.3.2 胚胎细胞DNA 为模板进行的PCR 反应  45
    4.3.3 试剂盒的胚胎性别鉴定检测分析  45
  4.4 实验结果与分析  45-48
    4.4.1 成纤维细胞PCR 性别鉴定结果  45-46
    4.4.2 胚胎细胞PCR 性别鉴定结果  46-47
    4.4.3 试剂盒PCR 性别鉴定结果  47
    4.4.4 试剂盒冻存后PCR 性别鉴定结果  47-48
    4.4.5 单重PCR 方法胚胎性别鉴定的部分结果  48
  4.5 讨论  48-50
第五章全文结论  50-51
参考文献  51-57
致谢  57-58
作者简历  58

快速PCR方法的建立及其在牛精子和胚胎性别鉴定中的应用

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