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微丝相关的微囊藻毒素毒性机理研究

作　者: 曾晶
导　师: 沈其君；徐进
学　校: 宁波大学
专　业: 流行病与卫生统计学
关键词: 微囊藻毒素LR HL7702细胞 微丝重组 MAPK信号通路 ARP2/3 Cofilin VASP Ezrin
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：水体富营养化导致蓝藻水华频繁发生。蓝藻水华不仅严重降低水体利用价值，而且很多蓝藻（主要是铜绿微囊藻）还能产生毒素——微囊藻毒素（Microcystin, MC），对人类健康构成威胁，其中存在较多、毒性较大的是微囊藻毒素LR（Microcystin-LR, MC-LR）和RR。同位素示踪发现MC进入动物体内后主要分布在肝脏，提示肝脏可能是它的主要靶器官，可引起肝细胞损伤、原发性肝癌、肝细胞肿胀和坏死。MC肝脏毒性的分子机制到目前为止已有了比较广泛的研究，也取得了一定的研究成果，但其具体机制仍存在很多疑问，尤其是细胞骨架在MC毒性效应中的作用。因此，我们选择正常人来源的肝细胞系HL7702作为研究对象来研究细胞骨架中微丝参与MC-LR的具体毒性机理。方法：1、用MTT法检测MC-LR对HL7702细胞增殖的影响，不同浓度的MC-LR（0-10μM）染毒处理HL7702细胞。然后，根据MTT结果确定后续实验的染毒浓度。2、用微丝特异染色剂荧光标记的鬼笔环肽对细胞进行染色，在激光共聚焦显微镜下观察其形态的变化。3、再用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法分析微丝相关基因转录、翻译和磷酸化水平的变化，以及MAPK信号通路在此过程中的作用。结果：1、不同浓度MC-LR（0、0.001、0.01、0.1、1、10μM）暴露24h后，HL7702细胞的数量随着MC-LR染毒浓度的升高而逐渐减少，在染毒浓度达到1μM时开始有统计学意义。2、MC-LR处理后，HL7702细胞的大小及形态仍保持完整，但微丝的正常纤维状结构逐渐消失，可见明显的致密束形成，微丝结构破坏、重组。3、MC-LR处理后，微丝相关基因的转录和翻译水平没有发生明显改变，也不具有统计学意义。4、MC-LR处理细胞后，微丝相关蛋白的磷酸化水平发生明显改变，p-VASP（Ser239）、p-VASP（Ser157）和p-Ezrin（Thr567）在染毒浓度达到10μM时显著升高并具有统计学意义，p-Cofilin（Ser3）无明显改变。5、MC-LR处理后，MAPK信号通路中P38、ERK1/2和JNK的蛋白表达没有明显改变，但其磷酸化水平与MC-LR有剂量依赖关系，在高浓度时显著升高并具有统计学意义。6、P38和ERK1/2抑制剂组的蛋白磷酸化水平向对照组恢复，与不加抑制剂的MC-LR处理组相比显著降低并具有统计学意义，说明P38和ERK1/2抑制剂能显著抑制MC-LR诱导的微丝相关蛋白过磷酸化，而JNK抑制剂无明显效果。结论：1、MC-LR能抑制HL7702细胞增殖，并引起微丝结构的紊乱和重组。2、MC-LR可引起微丝相关蛋白VASP和Ezrin过磷酸化。3、MC-LR可激活MAPK信号通路，且该信号通路中的P38和ERK1/2参与了MC-LR诱导的微丝相关蛋白过磷酸化。4、MC-LR的肝细胞毒性可能是通过PP2A抑制、MAPK信号通路（尤其是P38和ERK1/2）的激活，引起微丝相关蛋白的过磷酸化，最终导致微丝结构的破坏和重组、肝细胞损伤。

全文目录


摘要  2-4
Abstract  4-7
1 引言  7-12
2 实验材料  12-18
  2.1 微囊藻毒素 LR(MC-LR)  12
  2.2 细胞系  12
  2.3 细胞培养及处理用液  12
  2.4 MTT 实验试剂  12-13
  2.5 Bradford 法蛋白定量试剂  13
  2.6 蛋白免疫印迹相关试剂  13-15
  2.7 细胞免疫荧光试剂  15
  2.8 其他主要试剂  15-16
  2.9 主要仪器  16-18
3 研究方法  18-22
  3.1 细胞培养及处理  18
  3.2 MTT 法  18
  3.3 细胞微丝结构观察  18-19
  3.4 mRNA 检测  19-20
  3.5 细胞总蛋白的提取  20
  3.6 Western blotting 法检测相关蛋白表达水平  20-21
  3.7 数据处理  21-22
4 结果  22-31
  4.1 MC-LR 对 HL7702 细胞增殖的影响  22
  4.2 MC-LR 对 HL7702 细胞微丝形态的影响  22-23
  4.3 MC-LR 对 HL7702 细胞微丝相关基因转录水平的影响  23-24
  4.4 MC-LR 对 HL7702 细胞微丝相关蛋白表达的影响  24-26
  4.5 MC-LR 对 HL7702 细胞微丝相关蛋白磷酸化水平的影响  26-27
  4.6 MC-LR 对 HL7702 细胞 MAPK 信号通路的影响  27-29
  4.7 MAPK 信号通路对 MC-LR 引起微丝相关蛋白过磷酸化的影响  29-31
5 讨论  31-36
  5.1 MC-LR 对 HL7702 细胞增殖和微丝形态的影响  31-32
  5.2 MC-LR 对 HL7702 细胞微丝相关蛋白的影响  32-33
  5.3 MC-LR 对 HL7702 细胞 MAPK 信号通路的影响  33-36
6 结论  36-37
7 参考文献  37-43
附录A：综述  43-58
8 在学研究成果  58-59
9 致谢  59

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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