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基因区与基因间区五条靶序列DNA甲基化在甄别同卵双生个体中的研究

作　者: 付光平
导　师: 李淑瑾
学　校: 河北医科大学
专　业: 法医学
关键词: 同卵双生子 DNA甲基化基因区序列基因间区序列重亚硫酸氢盐转化焦磷酸测序
分类号: D919.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：由于同卵双胞胎（monozygotic twins, MZ）是由同一个受精卵发育而来，拥有相同或高度相似的DNA序列，采用目前使用的个体识别技术，如短串联重复（short tandem repeat, STR）分型技术、单核苷酸多态性（single nucleotide polymophism, SNP）分型技术，mtDNA分型技术等，均不能对其进行区分，这给涉及MZ的案件侦破带来极大困难和阻力。表观遗传学是研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰，其中DNA甲基化是最主要的一种表观遗传修饰。近年来研究发现MZ个体的DNA甲基化存在差异，且本课题前期通过对1对新生儿MZ的全基因组甲基化谱的检测，发现在基因区和基因间区共有2205条DNA甲基化差异序列，并筛选出113条序列作为后续分析的候选位点。本研究将从中进一步筛选一些序列，利用焦磷酸测序测序技术对大样本双生子进行DNA甲基化定量分析，探讨各序列甲基化能否鉴别MZ，评估其鉴别能力，并比较基因区和基因间区DNA甲基化鉴别MZ能力的大小，旨在为从遗传学角度解决鉴别MZ不同个体的难题提供基础数据，为建立可行的解决方案提供有价值的参考。方法：应用Qiagen公司的QIAamp DNABlood kit提取血液样本的DNA,应用漱口水提取试剂盒（泰州泰朗生物科技服务有限公司）提取漱口水的全基因组DNA。利用Goldeneye DNA身份鉴定系统的BASIC试剂盒检测双生子DNA样本的STR分型，以明确每对双生子样本的同异卵情况。应用ZYMO公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit对基因组DNA进行重亚硫酸氢盐转化，转化后的DNA做为模板，分别扩增GS1、 GS2、GS3、IGS1、IGS2五条靶序列。对扩增产物进行单链纯化，然后进行焦磷酸测序，获得五条序列20个CpG位点甲基化水平的定量数据。应用Spearman相关检验、pearson相关分析、t检验、χ2检验、秩和检验等方法进行统计学分析。结果：15条靶序列的特征GS1（Genebank Accesion number: XM₀06726188）位于跨膜通道样蛋白4（transmembrane channel-like4，TMC4）的外显子区，扩增片段为85bp，可检测6个CpG位点；GS2（Genebank Accesion number: NM₀01159387）位于beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase2（B4GALNT2）的外显子区，扩增片段为105bp，可检测2个CpG位点；GS3（Genebank Accesionnumber: NM₀01256358）位于酪氨酸蛋白激酶6（protein tyrosine kinase6,PTK6）的外显子区，扩增片段为129bp，可检测5个CpG位点。IGS1和IGS2均位于3号染色体（Genebank Accesion number:NC₀00003.12）的基因间区，IGS1扩增片段为139bp，可检测4个CpG位点； IGS2扩增片段为164bp，可检测3个CpG位点。25条靶序列的平均DNA甲基化水平及组织差异性分析在所调查的352个血液样本中，GS1、GS2、GS3、IGS1、IGS2序列的平均甲基化水平为88%、89%、92%、85%、82%。血液样本中GS1、GS3序列11个CpG位点的平均甲基化水平分别为92%、83%、74%、97%、93%、89%、93%、98%、90%、90%、89%，但在126个漱口水样本中的平均甲基化水平分别为66%、65%、57%、68%、66%、62%、89%、96%、86%、87%、88%明显低于血液样本。其中102名个体同时包括血液样本和漱口水样本，对该102名个体血液与漱口水样本的甲基化水平进行配对t检验，发现GS1序列和GS3序列DNA甲基化水平在同一个体漱口水与血液样本中也存在明显差异，血液的甲基化程度显著高于漱口水的甲基化程度。相关系数矩阵显示，在每一个序列内部，各CpG位点之间甲基化程度的表现为一定的相关性。3双生子之间甲基化差异分析以焦磷酸测序仪灵敏度5%为标准，我们设定，若双生子之间甲基化水平差值大于5%，则被认为有差异，小于或等于5%的视为无差异。3.1血液样本各序列双生子间差异分析GS1、GS2、GS3、IGS1、IGS2序列MZ之间甲基化水平有差异的分别有38对、0对、18对、31对、57对，DZ之间甲基化水平有差异的分别有21对、0对、5对、23对、12对。5条序列累积能够区分93对MZ和39对DZ，分别占MZ及DZ总样本量的77.50%及67.24%，表明在血液样本中5条序列20个CpG位点区分MZ的累积鉴别能力为77.50%，区分DZ的累积鉴别能力为67.24%。对各序列鉴别MZ与DZ的能力进行χ2检验比较分析，发现基因区GS1及GS3鉴别MZ与DZ的能力无差异，二个序列联合起来计算，鉴别MZ与DZ的能力也无明显差异；但基因间区IGS1鉴别MZ能力小于DZ，IGS2鉴别MZ的能力大于DZ，二者联合起来，差异无统计学意义。此外，我们分析了基因区和基因间区序列鉴别MZ能力是否存在差异。结果显示，基因区的3条序列13个CpG位点能够区分50对MZ及23对DZ，分别占MZ及DZ总样本量的41.67%及39.66%。而基因间区2条序列7个CpG位点能够区分73对MZ及29对DZ，分别占MZ及DZ总样本量的60.83%及50.00%。经χ2检验，基因间区序列鉴别MZ的能力明显高于基因区序列。3.2漱口水样本各序列双生子间差异分析漱口水样本GS1、GS3序列MZ之间甲基化水平有差异的分别有40对、15对，DZ之间甲基化水平有差异的分别有10对、1对。2条序列累积能够区分42对MZ和10对DZ，分别占MZ及DZ总样本量的84.00%及76.92%，表明在漱口水样本中2条序列11个CpG位点区分MZ的累积鉴别能力84.00%，区分DZ的累积鉴别能力为76.92%。经χ2检验，漱口水样本的鉴别能力明显高于对应序列血液样本的鉴别能力。3.3双生子之间甲基化差别与年龄的相关性分析为探讨双生子间甲基化的差别是否随年龄增加而增大，我们分析了二者之间的相关性。结果表明，IGS1序列、IGS2序列在MZ之间的DNA甲基化差异与年龄呈较弱的负相关，相关系数分别为-0.276、-0.229，表现为，随着年龄增大，MZ之间的甲基化差异呈现减小的趋势。其余序列甲基化在MZ之间的差异与年龄均无明显相关性。4年龄、性别、民族、吸烟与甲基化的相关性4.1年龄对5条靶序列甲基化的影响Spearman秩相关分析结果表明，血液样本中GS1、GS3、IGS1、IGS2四条靶序列及漱口水样本中GS3序列的甲基化程度均与年龄呈弱相关，相关系数分别为0.223、-0.214、-0.376、-0.202及0.241。我们按照10岁的年龄段将样本分为5个年龄组：0-10岁、11-20岁、21-30岁、31-40岁、41-50岁及>50岁。比较各年龄组间甲基化程度的差异，发现血液样本的所有5条靶序列各年龄组间甲基化程度存在显著差异，漱口水样本GS3序列甲基化程度在各年龄组间存在差异，只有漱口水样本GS1序列甲基化水平在各年龄组无显著差异。差异主要表现在低年龄组（0-10岁组）与高年龄组（31-40、41-50、＞50岁组）间。4.2性别对5条靶序列甲基化的影响Spearman秩相关分析结果表明，性别因素与血液样本中5条靶序列及漱口水样本中2条靶序列的甲基化程度均无明显相关性。不同性别间的甲基化水平比较结果也表明，在所检测的所有序列中，甲基化程度在不同性别之间无显著差异。4.3民族对5条靶序列甲基化的影响样本志愿者来自六个民族：汉族、哈尼族、拉祜族、壮族、回族及彝族，因后四个民族样本较少，合并为一组。Spearman秩相关分析结果表明，只有血液样本中GS2序列甲基化程度与民族具有较弱的相关性，r=0.243，其余各序列甲基化程度均与民族无明显相关性。在血液样本GS1序列的CpG3位点、GS2序列的CpG1位点、GS3序列的CpG5位点，汉族与其他民族甲基化水平有差异。GS2序列的CpGmean汉族与其他民族甲基化水平也表现出显著差异。4.4吸烟对5条靶序列甲基化的影响Spearman秩相关分析结果表明，只有血液样本GS3序列甲基化程度与吸烟呈弱相关，其余序列甲基化程度均与吸烟无显著相关性。血液样本GS3序列的CpG5、IGS1序列的CpG2位点、IGS2序列的CpG1位点，吸烟与不吸烟者甲基化水平有明显差异，GS3序列的CpGmean吸烟与不吸烟者甲基化水平也表现出显著差异。漱口水样本GS3序列的CpG4位点吸烟与不吸烟者也存在显著差异。结论:1)本研究选用的5条靶序列DNA甲基化鉴别MZ的累积效能为77.5%，除GS2外，其余4条靶序列均有一定的鉴别能力，可作为候选序列。基因间区两条序列鉴别MZ能力明显高于基因区的三条序列，提示我们尽量选择基因间区序列作为候选序列，以提高甄别效能。同一序列漱口水样本鉴别MZ能力高于血液样本，说明漱口水样本的甲基化差异程度大于血液样本，甄别MZ的价值优于血液样本。基因间区两条序列DNA甲基化在MZ双生子个体间的差异程度随年龄增加呈现较弱的下降趋势，原因有待进一步研究。2)5条靶序列中除GS2外的DNA甲基化程度均与年龄呈一定的相关性，且不同年龄组间存在显著差异，表明年龄是影响DNA甲基化的一个重要因素。5条序列中，只有GS2（B4GALNT2）的外显子甲基化与民族具有相关性，汉族与哈尼族和其他民族DNA甲基化表现出明显差异，表明该基因在不同民族间的甲基化程度不同，可能成为种族鉴别的遗传标记。5条序列中，只有GS3（PTK6）的外显子甲基化与吸烟有关，表明吸烟可能影响该基因的甲基化修饰及表达调控。3)GS1和GS3两条序列DNA甲基化表现出明显的组织差异性，血液样本的甲基化程度明显高于漱口水样本，提示我们在实际应用中，一定要采样相同的组织样本进行比对。

全文目录

摘要  4-9
ABSTRACT  9-16
英文缩写  16-17
前言  17-18
材料与方法  18-23
结果  23-28
附图  28-48
附表  48-55
讨论  55-60
结论  60-61
参考文献  61-64
综述法医 DNA 甲基化分型：机遇与挑战  64-83
  参考文献  75-83
致谢  83-84
个人简历  84

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