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NPM1基因突变AS-PCR检测方法的建立及其在白血病中的应用

作　者: 简正伟
导　师: 万腊根
学　校: 南昌大学医学院
专　业: 临床检验诊断学
关键词: NPM1 基因突变 AS-PCR方法
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究背景和目的：急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia, AML）是多能干细胞发生突变所形成的一类造血系统的恶性克隆性疾病。随着分子生物学技术不断地应用于临床，越来越多的基因突变检测在白血病诊断、治疗监测和预后评估中得到应用并发挥重要的作用。在急性髓系白血病中，核仁磷酸蛋白（nucleophosmin，NPM1）编码基因是突变率最高的基因之一，其突变状态对白血病患者的生存和预后均有重要影响。因此，对NPM1基因突变的检测显得尤为重要。本课题旨在建立检测NPM1基因突变的等位基因特异性PCR方法，为临床检测急性髓系白血病病人NPM1基因突变提供灵敏、高效而又简便的方法，从而为临床进行急性髓系白血病的治疗效果监测和预后评估提供实验依据。研究策略与方法：1、分别设计并合成5对引物，以健康人淋巴细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到野生型NPM1基因片段和A、B、C、D四种突变型的NPM1基因片段，并分别克隆至载体pEGFP-C1中，作为后续检测的标准品。2、AS-PCR方法的建立。根据等位基因特异性PCR方法（AS-PCR）的原理，设计一对特异引物，以四种突变型的pEGFP-C1-NPM1重组质粒为模板，优化反应体系和反应条件。摸索出该方法检测的最低检测下限，并验证该方法的可行性。3、利用AS-PCR方法检测急性白血病患者NPM1基因突变情况，并分析基因突变与FAB分型、遗传学异常以及预后的相关性。实验结果：1、构建了野生型pEGFP-C1--NPM1（wild）和A、B、C、D四种突变型的pEGFP-C1-NPM1五种重组质粒,经PCR扩增和测序鉴定与预期结果一致，证明质粒构建成功。2、建立了可以同时检测NPM1基因A、B、C、D四种突变体的AS-PCR方法,该方法的检测上限为109copies/ml，检测下限为103copies/ml，野生型NPM1基因在103copies/ml-109copies/ml间对该方法无干扰。3、对临床231例初诊白血病患者标本进行检测，其中62例患者标本有NPM1基因突变，阳性率为26.8%（62/231）。其中，M1占33.3%（3/9）；M2占38.9%（28/72）；M3占14%（7/50）;M4占15%（3/20）;M5占41.7%（10/24）;M6占25.0%（1/4）;ALL占25.0%（6/24）;CLL占33.3%（2/6）；CML占11.1%（1/9）和特发性血小板减少性紫癜占100%（1/1）。结论：1、成功构建了野生型pEGFP-C1--NPM1（wild）和A、B、C、D四种突变型的pEGFP-C1--NPM1五种重组质粒。2、建立一种可以同时检测A、B、C、D四种高频突变的AS-PCR方法，能够给临床检测NPM1基因突变提供一种新型的检测方法。3、在AML患者中NPM1突变有明显差异，其中M5和M2患者较为多见。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
第1章 引言  11-13
第2章 重组质粒标准品的构建和稳定性评价  13-28
  2.1 概述  13
  2.2 材料和方法  13-23
    2.2.1 材料  13-16
    2.2.2 方法  16-23
  2.3 结果  23-26
    2.3.1 野生型和四种突变型的 NPM1 基因片段的获取  23
    2.3.2 重组质粒的酶切鉴定  23-24
    2.3.3 重组质粒测序鉴定  24-25
    2.3.4 质粒标准浓度的测定  25-26
  2.4 讨论  26-27
  2.5 小结  27-28
第3章 AS-PCR 方法的建立  28-37
  3.1 概述  28-29
  3.2 材料和方法  29-31
    3.2.1 材料  29
    3.2.2 方法  29-31
  3.3 结果  31-34
    3.3.1 AS-PCR 条件的优化  31
    3.3.2 AS-PCR 方法的检测限分析  31-32
    3.3.3 AS- PCR 方法的干扰实验  32-33
    3.3.4 AS-PCR 方法和测序方法比较  33-34
  3.4 讨论  34-35
  3.5 小结  35-37
第4章 AS－PCR 在急性白血病患者ＮＰＭ１突变检测中的应用  37-43
  4.1 概述  37
  4.2 材料和方法  37-38
    4.2.1 材料  37
    4.2.2 临床对象  37
    4.2.3 方法  37-38
  4.3 结果  38-41
    4.3.1 患者资料统计  38-39
    4.3.2 患者 NPM1 突变与 AML 分型的关系  39-40
    4.3.3 患者 NPM1 突变与染色体异常的关系  40-41
  4.4 讨论  41-42
  4.5 小结  42-43
第5章 结论  43-44
致谢  44-45
参考文献  45-48
攻读学位期间的研究成果  48-49
综述  49-54
  参考文献  53-54

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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