学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

嵌合EGFRvⅢscFv-ICOS-CD3ζ修饰T淋巴细胞的抗肿瘤实验研究

作　者: 冀莹莹
导　师: 韩双印
学　校: 新乡医学院
专　业: 内科学
关键词: 嵌合抗原受体 T淋巴细胞 胶质瘤 免疫疗法
分类号: R739.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 24次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


背景和目的发展抗肿瘤免疫治疗是一项具有高挑战性的工作,许多肿瘤表面的特异性抗原免疫原性很低。再加上肿瘤形成的免疫逃逸机制,使得它可以免受免疫系统的攻击,主要包括：处理加工抗原的能力下降、主要组织相容性复合体、免疫抑制性分子及细胞因子的表达下降。为了克服这一困难,科研人员不断尝试各种方法激活抗肿瘤免疫系统。其中包括：使用癌症疫苗、多克隆抗体的融合和免疫调节因子等。最具前景的就是自体肿瘤激活的T淋巴细胞,体外扩增到一定数目后进行过继性免疫治疗。目前应用这项技术已经取得了不错成果。但是,因为这种治疗需要一定数目的肿瘤特异性T细胞,使得这项技术现在仅应用于黑色素瘤。一些肿瘤内T细胞的数量很少,只有通过遗传修饰手段可以使其达到期望的数量。现已经报道的有两种方法,其一是多克隆T细胞可以靶向肿瘤抗原,此抗原经遗传修饰后具有T细胞受体特异性和亲和性。另外一种是通过修饰T细胞,使其表达嵌合性抗原受体来识别原始抗原。本课题在前人研究的基础上,利用分子克隆技术,构建EGFRvⅢ scFV-ICOS-CD3ζ,三质粒共转染293T细胞制备慢病毒(LV-EGFRvⅢ-ICOS/CAR),转染人外周血T淋巴细胞,探讨嵌合抗原受体EGFRvⅢ scFv-ICOS-CD3ζ修饰T细胞对表皮生长因子Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)阳性胶质瘤细胞的靶向杀伤作用,为肿瘤的靶向免疫治疗做出进一步的探索。方法1.利用分子克隆技术构建载体EGFRvⅢ scFv-ICOS-CD3ζ2.三质粒共转染293T细胞制备慢病毒(LV-EGFRvⅢ-ICOS/CAR),转染人外周血T淋巴细胞3.利用流式细胞仪和Western blot检测T细胞结合CAR的能力4.运用51Cr释放法检测ICOS/CAR+T淋巴细胞的特异性抗肿瘤效应5.采用ELISA法检测其细胞因子IFN-y的释放结果1.经PCR扩增、限制性内切酶酶切及核苷酸序列测定,证实获得pCDH-ICOS/CAR2.三质粒共转染293T细胞制备慢病毒,用p24ELISA法测定LV-ICOS-CAR的感染滴度约为1.8x106TU/ml3.慢病毒转染人外周血T淋巴细胞后,流式细胞仪检测CAR在T细胞表面的表达率为ICOS/CAR73.65%,该转染效率能够满足进一步的试验要求4. Western-Blot鉴定内源性CD3ζ表达,在57kD处有特异性的蛋白条带5.51Cr释放法证实ICOS/CAR+T淋巴细胞对EGFRvIII阳性的U87细胞有特异性杀伤作用6. ELISA法检测ICOS/CAR+T淋巴细胞细胞因子IFN-γ的释放,可高达(2103.6±97.58)pg/ml,证实了转染后淋巴细胞IFN-γ释放是EGFRvⅢ肿瘤抗原特异性的。结论EGFRvⅢ/CAR+T细胞在体外显示出肿瘤抗原特异性杀伤作用。本研究为脑胶质瘤细胞的靶向治疗提供了较为可靠的实验依据,为肿瘤免疫治疗早日应用于临床奠定了一定的基础。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-14
第一部分 嵌合抗原受体的构建  14-26
  1 材料  15-16
    1.1 主要仪器设备  15
    1.2 主要试剂/试剂盒  15-16
    1.3 主要培养基及液体试剂的配制  16
  2 方法  16-23
    2.1 pCDH-ICOS-CD3ζ载体的构建  16-20
    2.2 pCDH-EGFRvⅢscFv-ICOS-CAR载体的构建  20-23
  3 结果  23-24
    3.1 载体pCDH-ICOS-CD3ζ的鉴定  23
    3.2 载体EGFRVⅢ CAR的鉴定  23-24
  4 讨论  24-25
  5 结论  25-26
第二部分 EGFRvⅢ CAR修饰T细胞及体外抗肿瘤实验  26-43
  1 材料  27-29
    1.1 主要仪器设备  27
    1.2 主要试剂/试剂盒  27-29
  2 方法  29-39
    2.1 慢病毒的包装与鉴定  29-31
    2.2 人外周血CD3~+T细胞的分离及CAR修饰  31-34
    2.3 流式细胞仪检测修饰T细胞CAR表达  34
    2.4 Western blot法检测修饰T细胞CD3ζ表达  34-38
    2.5 ~(51)Cr释放法检测CAR+T细胞的细胞毒性  38
    2.6 ELISA法检测细胞因子IFN-γ的分泌  38-39
  3 结果  39-40
    3.1 慢病毒的包装与鉴定  39
    3.2 修饰T细胞表面CAR表达  39-40
    3.3 修饰T细胞CD3ζ表达  40
    3.4 修饰T细胞的选择性杀伤作用  40
    3.5 修饰T细胞的IFN-γ分泌  40
  4 讨论  40-42
  5 结论  42-43
附图  43-46
参考文献  46-48
综述  48-59
  参考文献  55-59
英文缩略词表  59-60
攻读学位期间发表文章情况  60-61
致谢  61-62
个人简历  62

相似论文

  1. STLV-1病毒间接ELISA方法建立及杂交瘤细胞株的筛选,R373
  2. PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞NF-κB信号的影响,S858.28
  3. PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞钙信号的影响及其机理初探,S858.28
  4. TACI-Ig对ConA活化淋巴细胞的染色质诱导SLE样小鼠模型的治疗作用,R593.241
  5. MMP-2、VEGF和Ki-67的表达与脑胶质瘤分级的相关性研究,R739.41
  6. 半胱胺制剂对新生犊牛早期断奶成功率和免疫功能的影响,S823.5
  7. 半胱胺对瘘管手术后山羊外周血T淋巴细胞增殖的影响及其机理研究,S858.27
  8. 弥漫大B细胞淋巴瘤患者外周血T淋巴细胞亚群与NK细胞检测的临床意义,R733.1
  9. 寻常型银屑病不同分期及证侯T淋巴细胞亚群的研究,R275.9
  10. 栀子苷及其代谢产物京尼平对人外周血T淋巴细胞的影响,R758.23
  11. 亚低温联合胸腺五肽对重型颅脑损伤患者T细胞亚群及预后的影响,R651.15
  12. 头孢噻肟对细胞内钙离子跨膜行为影响的研究,R96
  13. 脑胶质瘤中耐药相关基因的表达及临床意义,R739.4
  14. 自体CIK细胞过继免疫治疗恶性实体瘤的临床研究,R730.5
  15. 谷氨酸信号通路在淋巴细胞及白癜风免疫发病机制中的作用研究,R758.41
  16. 高分辨熔解曲线技术检测多药耐药基因SNP的方法建立和应用,R44
  17. 巯嘌呤甲基转移酶与儿童急性淋巴细胞白血病的相关性研究,R733.71
  18. 肿瘤浸润淋巴细胞在大肠癌中表达及预后意义,R735.34
  19. RNA干扰抑制硫氧还蛋白基因增强人脑胶质瘤U251对三氧化二砷敏感性的研究,R739.4
  20. 艾迪注射液对不同恶性肿瘤细胞放射增敏作用及机制研究,R285.5
  21. 系统性红斑狼疮患者外周血T淋巴细胞PD-1分子、单个核细胞PD-L1分子的表达,R593.241

中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 神经系肿瘤
© 2012 www.xueweilunwen.com