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镧化合物对宫颈癌凋亡相关microRNA的调控

作　者: 俞玲芳
导　师: 刘丝荪
学　校:
专　业: 妇产科学
关键词: 氯化镧 microRNAs 宫颈癌 let-7a miRNA miR-34a
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：分析镧化合物对宫颈癌凋亡相关microRNA的调控作用，探索镧抑制宫颈癌增殖、诱导其凋亡的分子机制，为治疗宫颈癌提供新靶点和新思路。方法：1、体内研究氯化镧对宫颈癌组织中凋亡相关microRNA表达的调控作用：建立小鼠宫颈癌皮下移植瘤模型，随机分为生理盐水组和氯化镧组（2mg/kg），采用实时定量PCR法检测小鼠皮下移植瘤和正常小鼠肌肉组织中凋亡相关miRNAlet-7a和miR-34a的表达。2、体外研究氯化镧对人宫颈癌细胞中凋亡相关microRNA表达的调控作用：（1）细胞培养与分组：HeLa细胞培养于含10%FBS的RPMI1640培养基中，置于5%CO2、37℃恒温密闭孵箱中常规培养，于对数生长期随机分组，即实验组（培养基中含有5、50、100μM的氯化镧）和对照组（培养基中不含氯化镧），根据指标检测需要于不同时间点取样待测。（2）指标检测：①观察氯化镧对人宫颈癌细胞的生长抑制作用：采用MTT比色法检测两组细胞的增殖情况；采用流式细胞术分析各组细胞周期阻滞情况。②观察氯化镧对人宫颈癌细胞中凋亡相关microRNA表达的影响：采用实时定量PCR法检测两组细胞中凋亡相关miRNAlet-7a和miR-34a的表达。③观察氯化镧作用人宫颈癌细胞后凋亡相关miRNAlet-7a和miR-34a的下游基因表达的变化：采用Caspase-3活性检测试剂盒检测各组细胞中Caspase-3活性；Western blot技术检测各组细胞中CyclinD1和Bcl-2的表达。结果：1、氯化镧对小鼠皮下移植瘤组织中凋亡相关miRNA let-7a和miR-34a表达的影响：氯化镧组（2mg/kg）let-7a的相对表达量为2.97±0.77，显著高于生理盐水组（0.09±0.08），差异有统计学意义（P<0.01）；氯化镧组（2mg/kg）miR-34a的相对表达量为3.15±1.17，亦显著高于生理盐水组（0.01±0.008），差异有统计学意义（P<0.01）；而let-7a和miR-34a在生理盐水组中的表达量明显低于在正常小鼠肌肉组织中的表达量，且均差异显著，P<0.05。由此说明，氯化镧能明显上调宫颈癌组织中let-7a和miR-34a的表达。2、氯化镧对人宫颈癌细胞中凋亡相关microRNA表达的调控作用：（1）氯化镧对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用：不同浓度的氯化镧（5，50，100μM）对HeLa细胞的生长抑制率分别为24%，51%，78%，均显著高于对照组（0，P<0.05），抑制效应呈剂量依赖关系。（2）氯化镧对人宫颈癌HeLa细胞的周期阻滞作用：随着氯化镧浓度提高，G1期细胞明显增多，5、50、100μM浓度组与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）；S期细胞明显减少，5、50、100μM浓度组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；G2期细胞也明显减少，5、50、100μM浓度组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。结果说明氯化镧能导致大多HeLa细胞阻滞于G1期，并呈一定的浓度依赖性。（3）氯化镧作用HeLa细胞后凋亡相关miRNA let-7a和miR-34a表达的变化：5μM和50μM的氯化镧作用人宫颈癌HeLa细胞后，let-7a的表达无明显变化，与对照组相比差异均不显著（P>0.05）；而100μM氯化镧则可显著上调let-7a的表达，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。低浓度氯化镧（5μM）对miR-34a表达的影响不显著；但50μM和100μM氯化镧则可显著上调人宫颈癌HeLa细胞miR-34a的表达，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。（4）氯化镧作用人宫颈癌细胞后凋亡相关miRNA let-7a和miR-34a的下游基因表达的变化：①Caspase-3活性分析：低浓度氯化镧（5μM）即可有效诱导活化型Caspase-3表达，且随着氯化镧浓度的升高，诱导作用呈逐渐增强趋势。②Western blot技术检测CyclinD1和Bcl-2表达的变化：随氯化镧浓度的增加（5、50、100μM），CyclinD1和Bcl-2蛋白的表达强度均呈明显下调趋势，并呈一定的剂量依赖效应。结论：氯化镧可能通过上调凋亡相关miRNA let-7a和miR-34a的表达，影响周期特异性蛋白CyclinDl和凋亡相关蛋白Caspase-3和Bcl-2的表达，从而发挥细胞周期阻滞效应，抑制宫颈癌细胞增殖并诱导其凋亡，进一步说明稀土化合物氯化镧具有良好的抑制宫颈癌效果并初步探讨其抗癌机制。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
缩略词表  10-11
第1章引言  11-13
第2章材料与方法  13-25
  2.1 材料  13-15
    2.1.1 实验细胞株  13
    2.1.2 实验动物  13
    2.1.3 实验药物  13
    2.1.4 主要试剂及材料  13-14
    2.1.5 主要仪器与设备  14-15
  2.2 方法  15-24
    2.2.1 器材的准备  15
    2.2.2 主要试剂与药物的配制  15-17
    2.2.3 肿瘤模型的建立、分组及给药  17
    2.2.4 细胞培养及分组  17-18
    2.2.5 MTT 比色法检测各组细胞增殖情况  18
    2.2.6 细胞周期分析  18-19
    2.2.7 实时定量 PCR 法检测组织及细胞中 let-7a miRNA 和 miR-34a 的表达  19-21
    2.2.8 Caspase-3 活性测定  21-22
    2.2.9 Western blot 技术检测组织及细胞中 CyclinD1、Bcl-2 的表达  22-24
  2.3 统计学处理  24-25
第3章结果  25-31
  3.1 氯化镧对小鼠皮下移植瘤组织中凋亡相关 miRNA let-7a 和 miR-34a 表达的影响  25-26
  3.2 氯化镧对人宫颈癌细胞中凋亡相关 microRNA 表达的调控作用  26-31
    3.2.1 氯化镧对人宫颈癌 HeLa 细胞生长的抑制作用  26
    3.2.2 氯化镧对人宫颈癌 HeLa 细胞的周期阻滞作用  26-27
    3.2.3 氯化镧作用 HeLa 细胞后凋亡相关 miRNA let-7a 和 miR-34a 表达的变化  27-28
    3.2.4 氯化镧作用人宫颈癌细胞后凋亡相关 miRNA let-7a 和 miR-34a 的下游基因表达的变化  28-31
第4章讨论  31-34
第5章结论  34-35
致谢  35-36
参考文献  36-39
附图  39-43
攻读学位期间的研究成果  43-44
综述  44-51
  参考文献  49-51

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