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波形蛋白启动子去甲基化在TGF-β₁诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用研究

作　者: 范宇
导　师: 马跃荣
学　校: 泸州医学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 波形蛋白转分化 DNA甲基化甲基化转移酶
分类号: R692
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：作为慢性肾脏疾病(chronic kidney diseases, CKD)发展到终末期，甚至完全失去肾脏功能的共同途径，肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)被认为是这一疾病发展过程的主要环节，而上皮-间质转分化（epithelial-mesenehymal transition，EMT）又是RIF发展过程中的重要组成部分，主要表现为肾间质成分的逐渐增多，如波形蛋白（vimentin）、平滑肌肌动蛋白（SMA）、胶原蛋白等，同时伴随有上皮成分的减少。转化生长因子β1（TGF-β1）是目前公认的最主要的肾脏促纤维化细胞因子，在一定条件和TGF-β1诱导下，肾小管上皮细胞在体外可以发生EMT过程。再有，DNA甲基化修饰是表观遗传修饰的重要方式，可以通过调控某些基因位点的甲基化状态而改变基因表达情况，从而引起相应的细胞表型，甚至功能的变化；甲基化转移酶1（methyltransferase1，DNMT1）作为调控基因甲基化状态的一种重要酶类，可能参与了某些基因的甲基化修饰过程。因此，我们旨在通过观察体外TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞(renaltubular epithelial cells, NRK)转分化(trans-differentiation)过程中，细胞形态的改变，以及上皮细胞源性蛋白（AE1/AE3）和间质细胞源性蛋白（vimentin）表达的变化情况，同时检测DNMT1mRNA和蛋白表达水平及波形蛋白(vimentin)启动子甲基化状态的变化，从而探讨体外诱导的EMT过程中可能的发生机制，为进一步研究提供理论基础。方法：首先，体外培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK），将NRK细胞分为对照组和实验组(TGF-β1诱导组)，经过体外细胞诱导后，倒置相差显微镜观察细胞形态的变化情况，并采用免疫细胞化学染色(ICC)的方法观察两组细胞广谱细胞角蛋白(AE1/AE3)及vimentin表达的情况；然后，应用重亚硫酸盐PCR直接测序(Bisulfite Genomic Sequence, BSP)的方法检测诱导前、后vimentin启动子的甲基化状态变化；最后，采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)方法分别检测诱导前、后DNMT1mRNA和DNMT1蛋白质的表达情况。结果：体外TGF-β1诱导前、后，NRK细胞的形态发生了不同程度的改变，并趋于间质细胞生长形态；经灰度值测定及统计学分析显示，体外TGF-β1诱导的NRK细胞转分化模型中，NRK细胞DNMT1mRNA和DNMT1蛋白质表达明显降低，且差异有统计学意义（P<0.05）；同时，诱导前、后vimentin启动子甲基化状态发生改变，诱导后vimentin启动子呈去甲基化状态，且vimentin蛋白质表达明显增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：在体外TGF-β1诱导后，NRK细胞发生了上皮细胞到间质细胞的表型转化，主要表现为细胞形态趋于间质细胞，且出现上皮源性抗原标志（AE1/AE3）表达的降低和间叶源性抗原标志（vimentin）表达的升高；诱导前、后NRK细胞vimentin表达量的明显升高可能与其启动子区，即包括转录起始位点附近靠近第一个外显子的200-300bp序列在内的某些基因位点甲基化状态的变化有关；DNMT1mRNA及蛋白质表达在诱导前、后的改变提示，其可能在vimentin甲基化状态的改变过程中起调控作用，并可能间接影响vimentin蛋白的表达，因此vimentin启动子区甲基化状态和DNMT1表达量的变化，可能在体外诱导NRK细胞EMT的过程中扮演着重要的角色，这为进一步研究提供了一定的理论基础，但具体机制有待进一步阐明。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
前言  9-12
材料与方法  12-24
结果  24-32
讨论  32-39
结论  39-40
参考文献  40-44
英汉缩略词对照表  44-45
致谢  45-46
综述  46-55
  参考文献  52-55

波形蛋白启动子去甲基化在TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用研究

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