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CXCL12/CXCR4在肝纤维化组织中表达及其作用机制研究

作　者: 朱东
导　师: 赵秀英
学　校: 首都医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: CXCL12-CXCR4生物轴肝纤维化 HSC
分类号: R575.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的研究显示CXC趋化因子配体12（Chemokine C-X-C motif ligand12, CXCL12）及其受体CXC趋化因子受体4（Chemokine C-X-C motif receptor4, CXCR4）与多种慢性肝脏疾病存在着一定的联系。本研究通过检测肝纤维化组织中CXCL12-CXCR4在转录及蛋白水平的表达，再利用体外实验研究CXCL12-CXCR4对人肝星状细胞（Hepatic stellate cell，HSC）的作用及趋化影响，分析CXCL12-CXCR4生物轴在肝纤维化进程中的作用。方法收集正常人（n=8）和乙肝肝纤维化（n=20）肝组织标本，置于-80℃保存。Trizol法提取人肝组织标本总RNA，逆转录成cDNA。设计引物，分别扩增内参β-actin、CXCL12α、CXCL12β及CXCR4特异序列片段，连接T载体。将重构质粒转入感受态细胞中后，筛选出目的质粒，并进行质粒小提、定量。分别以4种质粒为标准品，建立实时荧光定量PCR（Q-PCR）对肝组织中CXCL12α、CXCL12β和CXCR4的转录表达进行检测。利用人肝组织冰冻切片，以免疫组化方法分别检测CXCL12α、CXCL12β和CXCR4在肝组织中的表达情况，并在高年资病理医师的指导下进行结果判读。利用免疫荧光方法对CXCR4和1型胶原在肝组织内的表达进行定位检测。培养人肝星状细胞LX-2细胞系，待细胞状态稳定，利用血小板衍生因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）对其进行干预培养，分别提取干预组和对照组细胞的总蛋白，并进行蛋白定量，最后利用WB技术检测CXCR4蛋白以及GAPDH内参蛋白的表达并分析。利用细胞迁移实验检测CXCL12α、CXCL12β对HSC的趋化能力。待LX-2细胞生长状态良好时对其进行计数，并接种于Transwel小室，并在下室中分别加入CXCL12α、CXCL12β、PDGF（阳性对照）和PBS（阴性对照）。培养24h后，对聚碳酸酯膜上的细胞固定、染色，进行细胞计数并比较。结果采用Windows SPSS13.0进行统计学分析。结果经过软件分析，Q-PCR系统标准曲线相关系数均大于0.995，线性良好，结果可靠。在转录水平，CXCL12α、CXCL12β和CXCR4在正常肝组织及纤维化肝组织内均有表达，且CXCL12α转录亚型的表达量高于CXCL12β。对组间比较，CXCL12α和CXCL12β在纤维化组的表达量均值都高于正常组，但在两组间的差异无统计学意义，而CXCR4在肝纤维化组中的表达明显高于正常肝组织，差异具有统计学意义（P=0.019）。对肝组织切片进行免疫组化和免疫荧光染色发现：1、CXCL12α在正常肝组织和纤维化肝组织中均有表达，在正常胆小管上皮细胞和纤维化增生的胆管上皮细胞染色均为阳性。2、CXCL12β在肝组织切片中染色均为阴性，未见表达。3、CXCR4在正常肝组织和纤维化肝组织中均有表达，在正常肝组织中表达较少，主要在胆小管上皮表达，而在肝纤维化组织中，CXCR4在假小叶边缘纤维间隔区域及胆管上皮均有表达，相对与正常肝组织表达明显增多。4、纤维间隔内除有炎性细胞浸润染色阳性外，另有很多细胞核形状为梭形，CXCR4着色阳性，为肌成纤维细胞(Myofibroblast, MFB)。利用WB检测人肝星状细胞LX-2中CXCR4的表达情况，LX-2细胞CXCR4蛋白表达阳性，且经过PDGF激活后表达增高。通过细胞迁移实验分析CXCL12对LX-2细胞的趋化性，发现相对于阴性对照组，在Transwel下室加入CXCL12α、CXCL12β后，LX-2细胞通过聚碳酸酯膜的数目明显增多，有统计学意义（P<0.05）。结论1、CXCL12-CXCR4在纤维化肝组织中表达高于正常组。在转录水平，CXCL12α表达相对CXCL12β较高，为优势转录子。CXCR4在肝纤维化组织中表达明显高于正常肝组织。在蛋白水平，相对于正常肝组织CXCR4同样表达较多，说明CXCR4的表达与纤维化的形成相关。2、HSC表达CXCR4蛋白，且CXCR4在处于肝纤维化中心环节的MFB和维间隔区域染色阳性，更加提示其在HSC激活和纤维间隔的形成中发挥作用。3、体外实验证明，人肝星状细胞LX-2被刺激活化后CXCR4表达升高，说明CXCR4可能参与了HSC激活的过程。4、CXCL12能有效诱导LX-2细胞，说明CXCL12对HSC可以发挥趋化能力，很可能参与了HSC的迁移和纤维间隔形成的过程。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-10
前言  10-14
第一部分 CXCL12/CXCR4 生物轴在肝纤维化组织中表达研究  14-37
  研究对象和方法  14-28
  结果  28-34
  讨论  34-37
第二部分 CXCL12/CXCR4 生物轴在 HSC 中作用机制研究  37-48
  研究材料和方法  37-44
  结果  44-46
  讨论  46-48
结论  48-49
Reference  49-52
文献综述  52-63
  References  59-63
附录  63-65
攻读学位期间发表论文情况  65-66
致谢  66-67
个人简历  67

CXCL12/CXCR4在肝纤维化组织中表达及其作用机制研究

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