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建立环介导等温扩增方法检测腹泻患者中的小肠结肠炎耶尔森菌

作　者: 罗敏红
导　师: 俞守义
学　校: 南方医科大学
专　业: 流行病与卫生统计学
关键词: 小肠结肠炎耶尔森菌环介导等温扩增方法析因设计腹泻
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景：小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica, Y. enterocolitica),是近20世纪80年代以来引起国际上广泛关注的一种重要的感染性腹泻致病菌,于1933年在美国纽约州发现后,曾引起数次大规模的胃肠道内或和胃肠道外感染爆发。上个世纪80年代中期,我国曾发生2次大爆发,造成500多人感染。小肠结肠炎耶尔森菌是一种全球分布的食源性病原菌,可引起人类多种肠道症状,如腹泻、肠炎、肠系膜淋巴结炎以及末端回肠炎,以自限性疾病为主；还可通过淋巴系统播散,引起一系列肠道外并发症状,包括反应性关节炎、结节性红斑、心内膜炎,败血症等,不仅对人类身体健康产生较大危害,也严重影响了公共卫生,给人类以及社会带来较大的经济以及医疗负担。目前国内医院尚未把小肠结肠炎耶尔森菌列入常规的检测项目中,医务人员普遍缺乏对本菌的认识,临床医生在对胃肠道疾病进行诊断时也很少考虑小肠结肠炎耶尔森菌的感染,人们可能低估了该菌感染的真实情况。目前普遍用于小肠结肠炎耶尔森菌检测的方法有传统的细菌分离培养和生化鉴定、普通PCR法、Real-time PCR法等。传统的分离培养和生化鉴定对污染样本进行检测时都需要经过前期的增菌,然后再进行分离培养和十几项的生化鉴定,而该菌的致病数量低,培养增殖缓慢,分离成功率低,敏感性不高,耗时耗力,还可能耽误临床感染患者抗生素的使用。以PCR法为基础的核酸扩增技术则需要昂贵的实验设备,较高的检测费用、结果判断繁琐,对检测人员技术要求较高等,这些特点使其不适用于现场快速检测和基层单位推广普及使用。寻找一种新的快速、简便、廉价的检测方法成为研究的热点。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是近十年来发展起来的一种新型的敏感、特异、方便快捷的体外恒温链置换基因扩增技术,针对靶基因的6个区域设计2对特异性引物,利用具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下,特异、高效、快速地进行扩增,1小时内扩增效率可达到109-1010拷贝的数量级,终点产物检测通过肉眼观察即可。由于其经济、快速、实用而逐步应用在生命科学的各个领域如：病原体及其耐药性诊断、基因诊断与治疗、胚胎性别鉴定、食品卫生检验和环境监测等。可作为病原体所致疾病早期检测和鉴定的一种简单而快速的诊断方法,在对条件较差的基层单位,现场,战时野外环境,灾后地区病原体的现场快速检测有着广阔的应用前景。此外,查阅文献发现,现有研究中绝大多数学者在进行LAMP条件优化试验时,习惯性地对试验体系的影响因素进行逐一单因素优化,繁琐费时,存在较大的盲目性,而且得到的单因素最佳扩增效果组合在一起不一定是最佳的反应组合。有学者利用正交设计进行LAMP反应条件优化,正交设计能成倍地减少试验次数,但是也要注意,正交设计之所以能成倍减少试验次数,是以牺牲分析各因素的部分或大部分交互作用为代价的,且正交设计表设计较为麻烦。析因设计(也称全因子实验设计),即实验中涉及所有因素及所有水平全面组合形成实验条件,各实验条件下至少做2次独立重复实验。析因设计是对各因素不同水平的全部组合,故具有全面性和均衡性。析因设计的最大优点是所获得的信息量很多,可以准确地估计各实验因素的主效应的大小,还可估计因素之间各级交互作用效应的大小。自从著名的英国统计学家Fisher于20世纪30年代创立析因设计并首次将其应用在农业试验中,试验设计方法至今已经得到了充分的发展和广泛的应用,在工业、医药以及科学实验等各个方面均有其踪迹。研究目的1.建立粪便样本中的小肠结肠炎耶尔森菌的LAMP检测方法,将析因设计引入LAMP反应的条件优化试验中,并对影响LAMP反应的主要因素作进一步分析；2.对优化后确定的LAMP最佳反应体系进行特异度和灵敏度等指标的测试,并将其应用于临床腹泻样本的实际检测,同时联合普通PCR做平行检测,对所建立的LAMP方法的实际应用效果进行评价。研究方法1.参考文献设计的LAMP引物,把影响LAMP反应的主要因素FIP/BIP、 MgCl2、dNTPs作为优化对象,每个因素设定4个水平,建立4×4×4三因素析因设计表,根据设计表共进行64组处理,每组重复2次,对128组LAMP终点产物进行OD400测定,把测定的数值录入SPSS16.0软件进行统计分析,使用描述性分析和方差分析结果以及多重比较来确定最佳扩增反应体系,并对影响LAMP反应扩增效果的因素顺序进行分析；2.使用纯菌落DNA提取试剂盒和粪便DNA提取试剂盒分别对不同样本进行DNA提取,对小肠结肠炎耶尔森菌标准株和11株非小肠结肠炎耶尔森菌菌株进行LAMP扩增,检测所建立的LAMP反应体系的特异度。从小肠结肠炎耶尔森菌基因组DNA、纯培养菌落、模拟感染粪便样本三个方面对所建立的LAMP法进行灵敏度检测。3.收集广州市某社区医院和某二甲医院的腹泻病人粪便样本,并对样本进行前处理和过夜冷增菌处理,提取过夜冷增菌液的DNA,使用普通PCR法和优化后的LAMP法对收集回来的临床腹泻患者粪便样本中的小肠结肠炎耶尔森菌进行检测,并对检测阳性的冷增菌液标本进行细菌培养与鉴定。比较普通PCR法和LAMP法的检测情况。研究结果1.参照文献设计的4条LAMP引物,根据4×4×4三因素析因设计表完成了64次试验并重复2次,根据OD400值通过描述性分析、方差分析和各因素的多重比较确定FIP/BIP、MgCl2,dNTPs的最适合组合：FIP/BIP各1.6μM,dNTPs为1.6mM, MgCl2为2.0mM。最终的LAMP最佳反应体系,即在25μl反应体系中,FIP/BIP各1.6μM, F3/B3各0.2μM,1.6mMdNTPs,2.0mMMgCl2,8U Bst DNA聚合酶,2.5μl10×Thermopol缓冲液和5μl DNA模板。扩增程序为：63℃孵育60min,然后80℃孵育10min。经实验证明,该LAMP反应体系重复性好、可靠稳定。方差分析结果显示,FIP/BIP、MgCl2、dNTPs三因素存在交互效应,各因素之间互相影响,不是单独存在的。本试验条件下反应体系中3个主要因素对LAMP扩增效果影响从大到小依次为：FIP/BIP、Mg2+、dNTPs。2.对小肠结肠炎耶尔森菌以及11株非小肠结肠炎耶尔森菌进行LAMP扩增,仅小肠结肠炎耶尔森菌出现阳性结果,其余11株非小肠结肠炎耶尔森菌均为阴性,表明所建立的LAMP方法特异性好。以小肠结肠炎耶尔森菌标准菌株为试验菌株,结果用肉眼以及紫外透视仪两种方法结合观察,灵检出限显示,该LAMP法对小肠结肠炎耶尔森菌基因组DNA最低可检测浓度约为38.05fg/μl;对于细菌纯培养物检测极限约为15CFU/ml;直接对粪便样本中的小肠结肠炎耶尔森菌进行检测限为150CFU/g。3.收集广州市某社区医院和某二甲医院的腹泻病人粪便样本539例,对539例腹泻患者粪便标本进行LAMP检测后,成功检出13例样本中含有小肠结肠炎耶尔森菌,普通PCR检出11例。取13例阳性样本的冷增菌液进行分离培养发现,普通PCR检出的11例阳性样本均能培养出小肠结肠炎耶尔森菌,LAMP法比PCR多检出的2例阳性样本不能培养出小肠结肠炎耶尔森菌。以普通PCR为“金标准”,LAMP法的灵敏度为100%,特异度为99.62%,Youden指数为0.99,阳性预测值0.846,阴性预测值1.00,且与PCR法显示了较好的一致性(McNemar检验P=0.500; Kappa=0.915,P=0.000)。结论1.析因设计试验与方差分析相结合优化LAMP反应体系,比单因素逐一试验的方法科学可靠,适用于LAMP反应体系的快速优化。2.本研究参考文献针对小肠结肠炎耶尔森菌16S rDNA-23S rDNA间区序列设计的引物,对LAMP中的FIP/BIP、MgCl2、dNTPs三因素实现了成功优化。经优化的LAMP法特异度强,灵敏度高,快速简便,在恒温水浴锅中敷浴1小时便可完成,不需要昂贵精密的仪器和繁琐的结果判断,通过肉眼观察即可实现对扩增产物的检测。3.收集回来的腹泻标本进行LAMP法检测的过程包括过夜冷增菌、DNA提取以及LAMP法扩增和结果判定,全部步骤不到1天便可完成,高效、快速。对腹泻样本进行检测时,LAMP法与普通PCR法显示了良好的一致性。所建立的LAMP法适用于腹泻样本中小肠结肠炎耶尔森菌的检测。4. FIP/BIP、dNTPs、Mg2+对LAMP扩增效果均有影响,三者之间存在交互效应,使用析因分析确定LAMP最佳反应体系,更准确更合理。各因素对LAMP反应的影响效果大小依次为：FIP/BIP、Mg2+、dNTPs。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-15
前言  15-28
第一部分利用析因设计优化小肠结肠炎耶尔森菌LAMP反应体系  28-42
  一材料和方法  29-34
  二结果  34-38
  三讨论  38-42
第二部分 LAMP技术检测腹泻患者粪便中小肠结肠炎耶尔森菌  42-61
  一材料和方法  42-50
  二结果  50-55
  三讨论  55-61
全文小结  61-63
参考文献  63-71
附录  71-73
硕士期间论文发表的情况  73-74
致谢  74-76

建立环介导等温扩增方法检测腹泻患者中的小肠结肠炎耶尔森菌

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