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灯盏花素对高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞MyD88、TNF-α表达的影响

作　者: 钟晓娟
导　师: 魏连波
学　校: 南方医科大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 灯盏花素腹膜间皮细胞高糖 MyD88 TNF-α
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

每年因各种原因所致的终末期肾脏疾病患者(end-stage kidney disease ESKD)发病人数正逐年增加,据国内研究者推测我国有100万ESKD患者需行透析治疗。腹膜透析(peritoneal dialysis PD)已成为这些终末期肾脏疾病患者的重要选择,全球有20余万腹膜透析患者,占透析总人数的14%。它具有操作简便、对心血管影响小、保护残留肾功能、无需长期返回医院治疗(即病人可在家自行透析)等优点。PD可分为间歇腹膜透析(Intermittent Peritoneal Dialysis IPD)、持续性不卧床腹膜透析(Continuouse Ambulatory Pritoneal Dialysis CAPD)、持续循环腹膜透析(Automatic Peritoneal Dialysis APD)。临床观察发现长期腹膜透析易至腹膜结构的出现损伤,导致膜转运功能限制,最终导致超滤失败(ultrafiltration failure UFF),是腹膜诱析患者退出诱析的主要原因。研究发还现超滤失败发生率很高：PD进行4年后,UFF发生率约为35%。5%-10%长期PD患者因超滤失败转为血液透析。腹膜是一层生理性的半透膜,毛细血管壁、腹膜间质、间皮细胞层、以及透析液与间皮细胞间及血液与内皮细胞间滞留液体层都是腹膜溶质转运的主要屏障。人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells, HPMC)是构成腹膜表层主要的细胞群体,而腹膜间皮细胞向间充质细胞转分化是PD过程中引起腹膜纤维化(peritoneal fibrosis, PF)的始动和可逆环节。间皮细胞主要生理功能是减少腹腔内脏表面的摩擦,提供保护屏障,参与血管与腹腔之间的溶质交换,分泌细胞因子,促使腹腔内炎症细胞聚集,分泌扩血管物质,调节腹膜微循环。上皮细胞粘附力丧失,向肌成纤维细胞的表型转变是间充质细胞转分化(epithelial mesenchymal transition EMT)的关键步骤。诱导因素通过刺激间皮细胞产生多种细胞因子介导炎症反应。多种原因可致间皮细胞受损或凋亡,导致腹膜转运功能下降,出现UFF。腹膜透析机制为利用高浓度腹透液渗透原理,腹膜半透膜功能超滤体内水分及中分子物质。根据腹膜功能改变的特点,可将UFF分为4类,即腹膜通透性增高(Ⅰ型)、腹腔淋巴回流增高(Ⅲ型)、水通道蛋白(Ⅳ型)以及腹膜纤维化改变(Ⅱ型)。长期反复透析使腹膜间皮细胞上载体表达异常以及出现腹膜组织糖基化,腹膜超滤能力在腹透1年内丧失3%,在3年内10%,在6年常超过30%。近年研究发现Toll样受体(Toll-like recepters TLRs)介导的信号通路是炎症反应的桥梁,研究还表明其介导的炎症反应是导致腹膜超滤失败的重要因素,其中研究较为深入的主要是TLR4. TLRs是体内固有免疫系统中主要病原模式受体之一,能识别炎症反应过程中诱导的内源性配体,它的激活及其信号通路的开通在全身炎症反应及天然防御免疫中起着重要作用。根据信号传导是否依赖MyD88, TLRs信号传导可分为：一为MyD88依赖通路,二为非MyD88依赖通路,主要以第一条通路传导为主。由此可知MyD88是Toll样受体信号向下游转导的关键接头分子。TNF-α则是此信号通路下游释放的重要炎症因子,与IL-2, IL-6等细胞因子共同介导细胞毒和免疫炎症有关的免疫应答,损伤组织。MyD88、TNF-α的表达高低可反应腹膜间皮细胞TLR4信号通路介导炎症反应程度。综上所述,本课题通过观察灯盏花素对高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞(rat peritoneal mesothelial cells RPMCS)表达MyD88、TNF-α的影响,为减少腹膜间皮细胞的损伤及改善腹膜透析相关性腹膜炎的预后提供理论依据,为灯盏花素的临床应用提供理论及实验依据。具体如下：第一部分不同浓度葡萄萄糖腹膜透析液对大鼠腹膜间皮细胞增殖及表达MyD88、TNF-α的影响目的：探讨不同浓度葡萄糖腹膜透析液(peritoneal dialysis fluid PDF)对RPMCS增殖及表达MyD88、TNF-α的影响。方法：①原代大鼠腹膜间皮细胞的原代培养、分离、纯化及鉴定选择150±20g雄性SD大鼠,乙醚吸入麻醉后处死,无菌获取腹腔壁层腹膜,剥去血管、脂肪,用无菌PBS冲洗三次,加入0.125%胰蛋白酶15ml消化15min,消化过程中放入37℃孵育,每隔5min震荡1次,并在显微镜下观察组织的消化情况。离心收集细胞,用lml含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液(含青霉素100u/ml,链霉素100μg/ml,氢化可的松1μg/ml,胰岛素0.5μg/ml,转铁蛋白1μg/ml)重悬细胞,并接种于加有3ml完全培养液、底面积为21cm2的培养皿内,放入37℃5%CO2孵箱内培养,过夜后首次换液,每3天用不含抗生素的完全培养液换液,第3代细胞用于实验。形态鉴定：光镜下培养皿内大鼠腹膜间皮细胞初呈梭形,约7天左右细胞可达融合,融合后细胞呈多边形,形成铺路石样外观,抗角蛋白单克隆抗体、抗波形蛋白单克隆抗体等免疫荧光鉴定。取第三代细胞涂片,基姆萨染色涂片后,置于显微镜下观察细胞形态,并计算纯度。②取第三代对数期生长的RPMCS,按1×105接种于96孔板,培养24小时。待细胞贴壁后,用无血清培养液培养过夜。分为对照组(a组)、1.5%葡萄糖组(b组)、2.5%葡萄糖组(c组)、4.25%葡萄糖组(d组),分别刺激4h、6h、8h后,6个复孔内加入5mg/ml的MTT液20μL,继续培养4h,显微镜下可观察到细胞聚集形成雪花状的蓝紫色结晶,小心吸出液体,加入150μL DMSO在摇床上振摇10min。使用波长为490nm的酶标仪检测OD值。各组细胞贴壁后,用腹膜透析液培养6h,取上清液,按照ELISA试剂盒说明书指示操作。450nm紫外线下检测并建立标准曲线,根据标准曲线计算待测样品中MyD88、TNF-α的浓度(ng/ml)。结果：1、与对照组相较,三种不同浓度的葡萄糖组RPMCS的OD值显著降低(P<0.01),呈时间、浓度的依赖性,时间越长,葡萄糖浓度越高,OD值下降越明显(P<0.05)。2、各组细胞贴壁后在1.5%、2.5%、4.25%的腹膜透析液作用下培养6h,与对照组相较,MyD88、TNF-α表达显著增加(P<0.01),而且随着葡萄糖浓度升高,二者浓度越高(P<0.01)。结论：1、腹膜透析液可抑制RPMCS增殖,且与时间及浓度呈正相关关系,即浓度越高,作用时间越持久,抑制作用越明显。2、腹膜透析液可刺激RPMCS表达MyD88、TNF-α,且葡萄糖浓度越高,二者表达越显著。第二部分灯盏花素对高糖作用下RPMCS增殖及MyD88、TNF-α表达的影响目的：探讨灯盏花素对高糖作用下RPMCS增殖及MvD88、TNF-α表达的影响。方法：1、药物血清制备：16只雄性SD大鼠,体重180±30mg,分别给大鼠从尾端静脉注射7天,7天后分离血清。2、各浓度葡萄糖组培养细胞6h,并加入灯盏花素药物血清培养8h,分别检测各组细胞OD值及上清液中MyD88、TNF-α的浓度值。结果：1、三组不同浓度葡萄糖刺激细胞6h,灯盏花素干预8h后OD值相较差异具有显著统计学意义(P<0.05)。2、各组用灯盏花素干预前后上清液中表达的MyD88、TNF-α的浓度差异显著(P<0.05)。结论：1、灯盏花素可以减弱葡萄糖对RPMCS增殖的抑制作用。2、灯盏花素可以下调葡萄糖刺激细胞MyD88、TNF-α的表达。全文结论：含不同浓度葡萄糖的腹透液培养细胞后,能抑制RPMCS增殖,而且呈现出对时间及浓度正相关关系；细胞表达MyD88、TNF-α显著升高。当加入灯盏花素干预后葡萄糖抑制细胞增殖的作用减弱,上述二种炎症介质的表达明显下降。表明灯盏花素的抗凝、抗氧化等作用,可减少炎症反应产物,抑制葡萄糖及其糖降解产物对细胞的损害,进而缓解腹膜炎症及防止腹膜纤维化,保护腹膜功能,延长腹膜透析患者的透析寿命。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-15
前言  15-22
第一章腹膜透析液对大鼠腹膜间皮细胞增殖及表达MyD88、TNF-α的影响  22-45
  材料和方法  23-32
  结果  32-36
  讨论  36-41
  参考文献  41-45
第二章灯盏花素对高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞增殖及表达MyD88、TNF-α的影响  45-55
  材料和方法  45-47
  结果  47-50
  讨论  50-53
  参考文献  53-55
全文小结  55-56
攻读硕士期间成果  56-57
附图  57-60
中英文对照缩略词表  60-62
致谢  62-63

灯盏花素对高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞MyD88、TNF-α表达的影响

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