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山茱萸环烯醚萜苷对乙酰胆碱代谢酶系统的影响

作　者: 褚思娟
导　师: 李林
学　校: 首都医科大学
专　业: 药理学
关键词: 山茱萸环烯醚萜苷 乙酰胆碱酯酶 丁酰胆碱酯酶 胆碱乙酰基转移酶 提取工艺筛选 D-半乳糖 东莨菪碱 亚硝酸钠 学习记忆
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：阿尔茨海默病(AD)是老年人中最常见的中枢神经退行性疾病，临床上以进行性认知功能障碍和行为损害为特征。AD疾病进展期间，在Meynert基底核观察到胆碱能神经元持续丢失。中枢胆碱能神经功能失调是AD的重要发病机制之一。胆碱酯酶作为神经递质乙酰胆碱（ACh）的降解酶，能够使突触间隙的ACh含量减少。目前乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂可用于改善AD患者的认知障碍症状。山茱萸是传统的补益肝肾中药，环烯醚萜苷是山茱萸的主要有效成分之一。本实验室近年来的研究发现，山茱萸环烯醚萜苷（Cornel iridoid glycoside, CIG）能够通过抑制Tau蛋白过度磷酸化起到神经保护作用，并显著改善穹窿-海马伞切断致胆碱能损伤模型大鼠的学习记忆能力，但目前还没有CIG对胆碱酯酶的影响方面的报道。为此本研究在体外试验中观察了CIG对AChE、丁酰胆碱酯酶（BuChE）、胆碱乙酰基转移酶(ChAT)的影响，以探讨CIG治疗AD的作用机制。方法：（1）以人红细胞、大鼠全脑匀浆和电鳗AChE作为酶源，采用微量DTNB法测定CIG等药物对AChE活性的影响，并用Lineweaver-burk法（双倒数法）作图确定抑制作用的动力学。（2）以人血浆和大鼠全脑匀浆作为酶源，采用微量DTNB法测定CIG对BuChE活性的影响，并用Lineweaver-burk法（双倒数法）作图确定抑制作用的动力学。（3）以大鼠全脑匀浆作为酶源，应用ChAT活性检测试剂盒测定CIG对ChAT活性的影响。结果：（1）对4种药物的筛选试验结果显示，只有CIG对人红细胞和电鳗AChE活性具有抑制作用，另外3种药物二苯乙烯苷、淫羊藿苷和5-羟甲基糠醛对人红细胞和电鳗AChE无明显影响。（2）CIG对人红细胞、大鼠全脑匀浆和电鳗AChE均具有抑制作用，其抑制50%酶活性的浓度（IC50）分别为1.6g·L-1、3.3g·L-1和0.37g·L-1。CIG对AChE的抑制作用是可逆的，并且为竞争-非竞争混合型抑制类型。（3）CIG对人血浆和大鼠全脑匀浆BuChE均具有抑制作用，其IC50分别为2.9g·L-1和0.96g·L-1。CIG对BuChE的抑制为竞争-非竞争混合型抑制类型。（4）CIG对大鼠全脑匀浆ChAT活性有一定的促进作用。结论：CIG在体外具有双重抑制AChE和BuChE的作用，并且对ChAT活性有一定的促进作用，提示CIG可增强胆碱能系统功能，对AD的防治可能具有良好的应用前景。目的：抗AD中药复方是王永炎院士临床治疗老年性痴呆（AD）的经验方，含4味中药，单剂重量为30g生药，拟研制成为中药6类新药。在新药的临床前药学研究中，首先需进行提取工艺优选。药学研究单位已应用正交试验设计方法初步确定了4种不同的提取工艺，并制备了相应的浓缩液。本研究的目的是对不同提取工艺进行药效学比较，为确定新药最佳提取工艺提供药效学实验依据。方法：（1）采用D-半乳糖致脑老化小鼠模型，应用物体识别试验检测学习记忆能力，应用免疫组织化学方法检测海马区神经生长因子（NGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）的表达，比较4种工艺对模型小鼠的影响。（2）采用东莨菪碱致获得性记忆障碍小鼠模型，应用Morris水迷宫检测小鼠空间学习记忆能力，应用跳台试验检测被动回避记忆能力，比较4种工艺对模型小鼠的影响。（3）采用亚硝酸钠致巩固性记忆障碍小鼠模型，应用物体识别能力检测小鼠学习记忆能力，应用避暗试验检测被动回避记忆能力，比较2种工艺对模型小鼠的影响。结果：（1）抗AD中药复方4种提取工艺浓缩液（5g生药/kg）灌胃给药增高D-半乳糖小鼠模型物体识别试验分辨指数的药效作用比较：工艺1工艺3工艺2，而工艺4无效；增高海马神经营养因子表达的药效作用比较：工艺2工艺1工艺3，而工艺4无效。（2）4种提取工艺浓缩液（5g生药/kg）灌胃给药改善东莨菪碱小鼠模型Morris水迷宫试验空间学习记忆能力的药效作用比较：工艺2工艺1工艺3工艺4；改善跳台试验被动回避学习记忆功能的药效作用比较：工艺1工艺3工艺2工艺4。（3）2种提取工艺浓缩液不同剂量（5g生药/kg、10g生药/kg）灌胃给药增高亚硝酸钠小鼠模型物体识别试验分辨指数的药效作用比较：工艺2小剂量工艺1小剂量；工艺1大剂量工艺2大剂量；改善避暗试验被动回避学习记忆功能的药效作用比较：工艺1=工艺2。结论：4种工艺的综合药效学结果进行排序，工艺1的药效学作用最好，排名第一；工艺3排名第二,工艺2排名第三，但二者非常接近；工艺4的药效学作用最差，排名第四。

全文目录


第一部分 山茱萸环烯醚萜苷对乙酰胆碱代谢酶系统的影响  8-51
  中文摘要  8-10
  Abstract  10-13
  前言  13-15
  材料与方法  15-25
    1. 实验动物  15
    2. 药品与试剂  15-16
    3. 仪器与设备  16-17
    4. 溶液配制  17-19
    5. 实验方法  19-25
      5.1 微量 DTNB 法测定 AChE 活性  19-20
      5.2 微量 DTNB 法测定 BuChE 活性  20-21
      5.3 CIG 对电鳗 AChE 的动力学测定  21-22
      5.4 CIG 对人血浆 BuChE 的动力学测定  22
      5.5 大鼠全脑匀浆 ChAT 活性的测定  22-23
      5.6 放射配基结合分析  23-24
      5.7 数据处理与统计学分析  24-25
  实验结果  25-41
    1. 4 种药物对乙酰胆碱酯酶（AChE）作用的初步观察  25-31
      1.1 应用阳性对照药多奈哌齐验证 AChE 测定方法  25-27
      1.2 山茱萸环烯醚萜苷（CIG）对 AChE 的作用  27-28
      1.3 二苯乙烯苷（TSG）对 AChE 的影响  28-29
      1.4 淫羊藿苷（ICA）对 AChE 的影响  29-30
      1.5 5-羟甲基糠醛（5-HMF）对 AChE 的影响  30-31
    2. CIG 对 AChE 的抑制作用及其动力学  31-36
      2.1 CIG 对人红细胞 AChE 的抑制作用及其可逆性  31-33
      2.2 CIG 对大鼠全脑匀浆 AChE 的抑制作用  33-34
      2.3 CIG 对电鳗 AChE 的抑制作用及其动力学  34-36
    3. CIG 对丁酰胆碱酯酶（BuChE）的抑制作用及其动力学  36-40
      3.1 CIG 对大鼠全脑匀浆 BuChE 的抑制作用  36-38
      3.2 CIG 对人血浆 BuChE 的抑制作用及其动力学  38-40
    4. CIG 对大鼠全脑匀浆胆碱乙酰基转移酶（ChAT）的作用  40-41
  讨论  41-45
  结论  45-46
  参考文献  46-51
第二部分 抗 AD 中药复方 4种提取工艺的药效学比较  51-81
  中文摘要  51-53
  Abstract  53-56
  前言  56-58
  实验一：4 种提取工艺药物对 D-半乳糖小鼠模型的影响  58-65
    一、材料与方法  58-61
      1. 实验动物  58
      2. 药品与试剂  58
      3. 主要仪器  58-59
      4. 分组与给药  59
      5. 实验方法  59-61
        5.1 D-半乳糖小鼠模型制备  59
        5.2 物体识别试验  59-60
        5.3 免疫组织化学法检测脑内神经营养因子  60
        5.4 数据处理与统计学分析  60-61
    二、实验结果  61-65
      1. 物体识别试验  61
      2. 海马神经营养因子表达  61-65
  实验二：4 种工艺药物对东莨菪碱小鼠模型学习记忆的影响  65-70
    一、材料与方法  65-67
      1. 实验动物  65
      2. 药品与试剂  65
      3. 主要仪器  65
      4. 分组与给药  65
      5. 实验方法  65-67
        5.1 造模方法  66
        5.2 Morris 水迷宫试验  66
        5.3 跳台试验  66
        5.4 数据处理与统计学分析  66-67
    二、实验结果  67-70
      1. Morris 水迷宫试验  67-68
      2. 跳台试验  68-70
  实验三：2 种工艺药物不同剂量对亚硝酸钠小鼠模型学习记忆的影响  70-74
    一、材料与方法  70-71
      1. 实验动物  70
      2. 药品与试剂  70
      3. 主要仪器  70
      4. 分组与给药  70
      5. 实验方法  70-71
        5.1 造模方法  70-71
        5.2 物体识别试验  71
        5.3 避暗试验  71
        5.4 数据处理与统计学分析  71
    二、实验结果  71-74
      1. 物体识别试验  71-72
      2. 避暗试验  72-74
  综合讨论  74-77
  结论  77-78
  参考文献  78-81
文献综述  81-94
  参考文献  90-94
英文缩略词表  94-96
攻读学位期间发表论文情况  96-97
致谢  97-99
个人简历  99

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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