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胶类药材质量控制关键技术研究

作　者: 程显隆
导　师: 林瑞超
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中药化学
关键词: 胶类药材特征肽段液质联用技术主成分分析质量控制质量标准
分类号: R284
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

胶类药材是我国中药宝库中一类特殊的动物药,是由动物的皮、骨骼等经特殊工艺加工而成,常见的有阿胶、鹿角胶、龟甲胶及其相关中成药制剂,如复方阿胶浆、龟鹿二仙膏等。近年来,由于动物胶类药材的生产原料短缺,价格昂贵,部分生产企业为降低成本,用杂皮胶投料违法生产的情况比较严重,同时在高价胶类药材(龟甲胶及鹿角胶)生产过程中掺加低价胶类(阿胶或明胶)药材非法谋利的情况屡见不鲜,导致胶类药材的质量参差不齐、市场秩序非常混乱。然而,由于目前胶类药材的质量标准整体水平较低,长期缺乏专属性鉴别方法和高灵敏度的检测技术,面对以上质量问题,药品检验和监管部门往往束手无策。因此,建立准确性好、灵敏度高、专属性强的动物胶类药材的质量控制技术和方法,并应用于相关药品的质量控制标准中,必将极大推进我国胶类药品质量监管的科学性与有效性,对保障公众用药安全有效、维护市场公平公正以及保护消费者利益等方面产生深远的影响。本学位论文依据不同动物因物种差异,其胶原蛋白氨基酸序列必然存在一定的差异这一原理,采用液质联用多肽识别技术和数据处理软件对蛋白质酶解后的胶类样品(主含多肽混合物)进行分析处理,寻找并发现各胶类样品的特征肽段,同时借用近年来蛋白质及多肽序列研究的技术方法和成果,从分子层次研究各胶类药材的主体组分性质及具有专属性鉴别意义的特征多肽成分,从而建立基于胶原蛋白序列差异的胶类药材真伪鉴别方法。以期从根本上为胶类药材的质量控制和评价提供技术依据。论文围绕以上思路主要开展了以下几个方面的研究工作,并取得了一些创新性结果：一、采用蛋白质酶切技术和液质联用多肽识别技术对胶类药材进行研究。选择胰蛋白酶对鹿角胶、龟甲胶、阿胶、黄明胶、新阿胶的胶原蛋白进行酶解,得到酶解肽,进而采用液质联用多肽识别技术,建立5种胶类药材酶解肽图。并结合MakerLnyx软件,进行主成分分析和因子分析,找出了鹿角胶2个特征离子,龟甲胶3个特征离子,阿胶4个特征离子,黄明胶4个特征离子,新阿胶4个特征离子。进一步对各胶类特征离子的二级图谱的分析,结合MASCOT检索,鉴定了鹿角胶1个特征离子的序列,龟甲胶3个特征离子的序列,阿胶4个特征离子的序列,黄明胶4个特征离子的序列,新阿胶3个特征离子的序列。并按解析出的序列,进行化学合成,验证了部分序列的正确性。二、以鹿角胶的特征肽m/z732.8. m/z765.4,龟甲胶的特征肽m/z745.8, m/z631.3, m/z758.4,阿胶的特征肽m/z765.9, m/z618.8, m/z539.8,黄明胶的特征肽m/z641.3、m/z790.9, m/z604.8,及新阿胶的特征肽m/z925.4, m/z774.3.m/z739.8作为母离子,采用高效液相色谱-质谱联用技术,建立了各种胶类的特征图谱和质谱信息库,继而形成了胶类药材真伪鉴定和快速筛查智能检测技术平台。三、以标准化方法建立为目标,本研究开展了检测用标准物质的研制工作,首次研制标定出鹿角胶、龟甲胶、黄明胶对照药材和牛皮特征肽A对照品。并采用高效液相色谱-串联四级杆质谱联用技术,以鹿角胶、龟甲胶、阿胶、黄明胶对照药材和牛皮特征肽A为对照,建立了鹿角胶、龟甲胶、阿胶的定性鉴别方法和用于打击违法使用杂皮投料生产龟甲胶、鹿角胶、阿胶的补充检验方法。四、以胶原蛋白中的特殊氨基酸—羟脯氨酸为主要指标,建立了异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化-高效液相色谱法同时测定胶类药材中4种主要氨基酸(羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸)的含量测定方法,并进行了方法学的验证,提出了阿胶中4种主要氨基酸含量测定标准草案。本论文的特色与创新之处：(1)首次通过酶切技术及高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS/MS)技术,确定各不同胶类药材的专属性特征肽段,并通过氨基酸序列分析和特征肽段的化学合成等手段,验证了特征肽段序列的正确性；(2)首次将肽图分析和数学统计分析方法应用于胶类药材的真伪鉴定。通过各种胶类药材样品的色谱质谱信息库(色谱参数、质谱参数、特征肽段信息等)的建立和应用,首次建立胶类药材真伪识别专家系统；(3)首次建立了分析检测用标准物质及鹿角胶、龟甲胶、阿胶专属性强的胶类药材定性鉴别标准方法；(4)首次建立正品胶类药材中掺加杂皮的检测方法,并申报国家补充检验方法标准。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
缩略词表  8-9
前言  9-10
第一章概述  10-17
第二章胶类药材特征肽段的鉴定  17-60
  第一节酶解肽图的建立  17-25
  第二节特征肽段的寻找  25-34
  第三节特征肽段序列鉴定  34-54
  第四节特征肽段的人工合成及序列验证  54-60
第三章胶类药材专属性鉴别信息库的建立  60-74
  第一节特征图谱的建立  60-72
  第二节智能信息库的建立  72-74
第四章胶类药材质量控制标准方法研究  74-146
  第一节标准物质的研制  74-80
  第二节鹿角胶定性鉴别标准方法研究  80-86
  第三节龟甲胶定性鉴别标准方法研究  86-92
  第四节阿胶定性鉴别标准方法研究  92-98
  第五节复方阿胶浆定性鉴别标准方法研究  98-104
  第六节鹿角胶中牛皮源成分的检测方法研究  104-115
  第七节龟甲胶中牛皮源、驴皮源成分的检测方法研究  115-126
  第八节阿胶中牛皮源、驴皮源成分的检测方法研究  126-134
  第九节胶类药材氨基酸含量测定方法研究  134-146
第五章总结与讨论  146-148
参考文献  148-150
致谢  150-151
个人简历  151-154

胶类药材质量控制关键技术研究

内容摘要

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