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刺参不同组织基因组DNA甲基化状态MSAP分析及HPLC方法的建立

作　者: 郭婷婷
导　师: 杨建敏
学　校: 上海海洋大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: DNA甲基化刺参 MSAP HPLC
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

DNA甲基化是一种重要的DNA修饰，它能在不改变DNA一级结构的情况下调控基因的表达，与胚胎发育、组织的分化与衰老密切相关。DNA甲基化是目前新的研究热点之一，是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，能够维持正常的细胞功能，在胚胎发育、肿瘤等疾病的发生、遗传印记中起着重要作用。甲基化在动植物遗传育种中的相关研究主要集中在动植物基因组的甲基化状态、DNA甲基化与基因表达调控、DNA甲基化与分子标记等。一、 MSAP技术分析刺参不同组织基因组DNA甲基化状态利用甲基化敏感扩增片段多态性(Methylation-sensitive AmplifiedPolymorphism, MSAP)技术对五头刺参成体的呼吸树、肠、肌肉和体壁四个组织的基因组DNA甲基化水平进行分析得出了各个组织的甲基化状态。利用MspI/HapII，分别和EcoRI组成两组内切酶酶切基因组，经过预扩增和选择性扩增两步将PCR产物经过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳获得MSAP图谱，条带片段大小多集中在100bp-750bp之间。出现在MspI和EcoRI酶切泳道的为全甲基化位点、出现在HapII和EcoRI酶切泳道的为半甲基化位点、同时出现在两条泳道的为非甲基化位点。通过Spss Statistics17.0统计分析各个组织间的有效数据得知，肠的总甲基化水平为28.0%是四个组织中最低的，其中全甲基化位点占15.97%；呼吸树的全甲基化水为35.77%，其中全甲基化位点占19.46%；体壁和肌肉的概率分别为33.51%和32.72%，全甲基化位点各占18.39%和19.18%。甲基化水平由高到低排列依次是呼吸树>体壁>肌肉>肠，不同组织间存在甲基化差异，而且肠与其他组织差异显著(P<0.05)，其余三个组织间差异不显著(P>0.05)，但是呼吸树与肌肉的半甲基化水平差异显著(P<0.05)。体壁与肌肉的差异不显著可能是由于肌肉依附在体壁上取样时分离不显著造成的，而肠和呼吸树是相互分离存在的组织，取样是彼此完全分离，相互间的干扰不强烈所以与其他组织有显著的差异，组织间的甲基化差异跟它们的功能分化相关。DNA甲基化在不同时期，不同组织的差异表达是动植物生长发育所必须的，实验发现刺参的基因组存在甲基化现象而且不同组织间甲基化程度不同，基因组中未发生甲基化的概率大于甲基化的概率，而发生甲基化的位点中全甲基化的概率又大于半甲基化，这可能与甲基化在功能基因调控中起着一定的作用相关。跟其他水产动物相比，刺参的甲基化水平属于中等程度。实验由MSAP分析差异位点通过切胶回收，克隆得到四个甲基化特异性片段，经测序分析功能未知，推测为刺参新功能基因或调控序列区。二、 HPLC检测刺参基因组DNA甲基化方法的建立将DNA水解成单核苷酸，采用高相液相色谱技术(High PerformanceLiquid Chromatography, HPLC)检测刺参基因组DNA甲基化状态，检测波长283nm，柱温30℃，流速1ml/min。分别从DNA样品前处理方法和色谱条件两大部分进行实验。样品前处理包括酸解和酶解两种方法，酸解方法采用高氯酸水解样品，分别设置了不同的水解温度(85℃、90℃、95℃、100℃)和水解时间(45min、55min、60min)，样品pH均为3~5，通过三种pH4.5的流动相进行行试验。酶解方法采用核酸酶、磷酸酶和二酯酶等水解样品，水解后的样品通过pH6.7的流动相上机检测。色谱条件主要优化了流动相(KH2PO4、戊烷磺酸钠、乙酸铵)的种类以及流动相与甲醇的不同配比(0%、2%、5%、7%)。通过比较得出优化后的实验条件：50μl DNA样品(含DNA6μg)加入30μl70%高氯酸，95℃水解55min，调节样品pH至3~5，通过流动相为5%甲醇-10mmol/L戊烷磺酸钠(pH4.5)检测时C、5-mC有较好的吸收峰；核酸酶水解样品在流动相为7%甲醇-7mmol/L乙酸铵(pH6.7)时有较好的吸收峰。两种水解方法经过HPLC检测显示，经核酸酶水解后的DNA中甲基化率比高氯酸水解所得样品要高，因为酶解更温和，对5-mC的损伤较小，测得的结果更准确，但是酶试剂价格较高，大量样品检测时高氯酸法更经济，方便。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-15
引言  15-24
  1 刺参（Apostichopus japonicus）的概述  15
  2 甲基化简介  15-18
    2.1 甲基化的作用机制  16-17
    2.2 DNA 去甲基化  17
    2.3 DNA 甲基化的生物学作用  17
    2.4 甲基化研究进展  17-18
  3 DNA 甲基化研究技术  18-22
    3.1 甲基化敏感扩增片段多态性 (Methylation-sensitive Amplified Polymorphism, MSAP)技术  18-20
      3.1.1 MSAP 技术原理  18-19
      3.1.2 MSAP 技术的优缺点  19-20
    3.2 高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)技术 3.2.1 HPLC 技术原理  20
      3.2.1 HPLC 技术原理  20
      3.2.2 HPLC 技术的优缺点  20
    3.3 SssI 甲基转移酶法  20
    3.4 免疫化学法  20-21
    3.5 氯乙醛法  21
    3.6 特定 DNA 片段甲基化检测  21-22
      3.6.1 基于重亚硫酸盐处理靶 DNA 法  21
      3.6.2 亚硫酸氢化测序与限制性分析  21
      3.6.3 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸  21-22
      3.6.4 荧光探针杂交法  22
  4. 本研究的目的及意义  22-24
第一章 MSAP 技术分析刺参不同组织基因组 DNA 甲基化状态  24-34
  1 材料与方法  24-30
    1.1 实验样品  24
    1.2 主要仪器  24-25
    1.3 主要试剂  25
    1.4 接头和引物  25-26
    1.5 实验方法  26-29
      1.5.1 DNA 提取  26
      1.5.2 酶切反应  26-27
      1.5.3 连接反应  27
      1.5.4 预扩增  27-28
      1.5.5 选择性扩增  28-29
    1.6 电泳检测与条带统计  29
      1.6.1 配制非变性聚丙烯酰胺胶  29
      1.6.2 凝胶电泳  29
      1.6.3 条带统计  29
    1.7 数据统计与分析  29-30
  2 实验结果  30-32
    2.1 刺参不同组织的甲基化状态  30-32
    2.2 不同组织间的甲基化概率  32
  3 讨论  32-33
  4 小结  33-34
第二章甲基化特异位点的克隆与筛选  34-40
  1 材料与主要试剂  34
    1.1 实验样品  34
    1.2 主要试剂  34
  2 实验方法  34-38
    2.1 实验前期准备  34-35
    2.2 MSAP 图谱的获得  35
    2.3 回收特异条带  35-36
    2.4 特异片段克隆  36-38
      2.4.1 连接  36
      2.4.2 转化克隆  36-38
    2.5 测序  38
  3 实验结果  38-39
  4 讨论与小结  39-40
第三章高氯酸水解 DNA 样品的 HPLC 检测  40-48
  1 材料、试剂与仪器  40-41
    1.1 实验样品  40
    1.2 主要仪器  40
    1.3 主要试剂  40-41
  2 方法与结果  41-46
    2.1 标准溶液和流动相的配制  41-42
      2.1.1 标准溶液的配制  41
      2.1.2 流动相的配制  41-42
    2.2 水解条件的设置  42-43
      2.2.1 高氯酸添加量的设置  42
      2.2.2 水解时间、温度的设置  42-43
    2.3 DNA 的处理与水解  43
      2.3.1 DNA 处理  43
      2.3.2 高氯酸水解  43
    2.4 HPLC 进样分析  43
    2.5 结果  43-46
  3 讨论  46-47
    3.1 色谱条件的探讨  46
    3.2 水解温度、时间对样品的影响  46-47
    3.3 pH 对检测结果的影响  47
  4 小结  47-48
第四章核酸酶水解刺参 DNA 样品的 HPLC 检测  48-54
  1 材料、试剂与仪器  48-50
    1.1 实验材料  48
    1.2 主要仪器  48
    1.3 主要试剂  48-49
    1.4 实验准备  49-50
      1.4.1 标准溶液配制  49
      1.4.2 试剂配制  49-50
  2 方法与结果  50-53
    2.1 实验方法  50-51
      2.1.1 DNA 前处理  50
      2.1.2 DNA 水解  50
      2.1.3 HPLC 检测  50-51
    2.2 实验结果  51-53
  3 讨论与小结  53-54
结论  54-55
参考文献  55-61
附录  61-65
已完成文章  65-66
致谢  66

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