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厚壳贻贝特殊活性蛋白的结构与功能研究

作　者: 孙敬敬
导　师: 廖智
学　校: 浙江海洋学院
专　业: 海洋生物学
关键词: 厚壳贻贝足丝黏附蛋白抗菌肽全长cDNA基因
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

贻贝隶属于软体动物门(Mollusca)，是一种常见的海洋双壳贝类，主要生长在海岛的东北面有海浪冲击的岩礁上，以浙江舟山海域分布最多。贻贝之所以能够牢固的粘附在潮湿和动荡的环境中的固体基质表面，是由于贻贝足丝蛋白极强的粘附性能,这对于理解足丝蛋白分子间的相互作用机制具有基础性和现实性的意义。贻贝粘附力强可以黏附在固体表面，如石头、木材、金属、混凝土、聚氯乙烯（PVC），聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚四氟乙烯（PTFE）。足丝的黏附强度取决于粘附蛋白的种类，蛋白彼此之间的相互作用，黏附基质的性质，黏附发生时的环境条件（例如盐度、温度、pH、季节），机体所处的生物学状态（年龄与代谢状况）以及贻贝的种类等。贻贝足丝中的蛋白质种类应该在35种以上，尚有大量的贻贝足丝蛋白分子未被鉴定。以厚壳贻贝（Mytilus coruscus）为研究对象，采取了蛋白质增溶抽提技术，利用醋酸-尿素抽提液和醋酸-盐酸胍抽提液，尽可能溶解贻贝足丝蛋白；同时采取shotgun质谱技术分析上述抽提后的可溶性蛋白和不溶性足丝蛋白；获得的质谱数据搜索贻贝的EST库。通过上述方法我们总计获得了14种新型贻贝足丝蛋白及其匹配的EST序列。通过对所匹配的EST序列进行分析，对14种新型厚壳贻贝足丝蛋白在足丝粘附过程中的功能进行了预测，上述研究为深入了解贻贝足丝的分子多样性以及足丝粘附机理奠定了基础。海洋生物药用多肽历来是海洋生物活性物质研究的热点领域。贻贝抗菌肽以其独特的结构和高效抗菌活性成为海洋生物药用多肽的重要内容。通过多步高效液相色谱蛋白质微量蛋白质测序和质谱分析，从厚壳贻贝血清中鉴定到一种命名为mytichitin-1的新型抗菌肽。利用RACE技术获得了mytichitin-1的全长cDNA，mytichitin-1的cDNA长度为1558bp，其推导的氨基酸序列为446个氨基酸残基，其中N端22个氨基酸残基为信号肽，C端55个氨基酸残基与从血清中分离鉴定的mytichitin-1吻合，表明mytichitin-1的前体肽至少经历了两次剪切过程，首先是信号肽的切除，之后C端55个残基的成熟肽被剪切并输送至血清中发挥抗菌活性。上述研究为深入了解贻贝的免疫防御机制，开发mytichitin-1来源的新型生物抗生素奠定基础。

全文目录

摘要  8-9
ABSTRACT  9-12
第一章贻贝足丝蛋白和抗菌肽的研究进展  12-24
  1.1 贻贝足丝蛋白  12-19
    1.1.1 背景  12-13
    1.1.2 贻贝足丝蛋白粘附机制  13-16
    1.1.3 贻贝足丝蛋白的相互作用  16-19
      1.1.3.1 一般表面分析技术  16-17
      1.1.3.2 贻贝足丝蛋白-基质和蛋白-蛋白的相互作用  17-18
      1.1.3.3 贻贝足丝蛋白仿生材料  18-19
  1.2 贻贝抗菌肽  19-24
    1.2.1 背景  19-22
    1.2.2 四种贻贝抗菌肽  22
      1.2.2.1 防御素（defensins）  22
      1.2.2.2 贻贝肽（myticins）  22
      1.2.2.3 贻贝素（mytilins）  22
      1.2.2.4 贻贝霉素（mytimycins）  22
    1.2.3 抗菌肽纯化技术  22-24
第二章利用质谱技术结合贻贝 EST 库搜索鉴定厚壳贻贝新型足丝蛋白  24-102
  2.1 实验材料与实验方法  25-35
    2.1.1 实验材料  25
    2.1.2 实验方法  25-35
  2.2 结果与讨论  35-99
    2.2.1 质谱分析及 EST 数据库搜索结果  35-99
  2.3 结论  99-102
    2.3.1 胶原蛋白类似分子  100
    2.3.2 参与形成分子交联的新型足丝蛋白  100
    2.3.3 参与足丝保护的新型足丝蛋白  100-101
    2.3.4 其他未知功能的新型足丝蛋白  101-102
第三章厚壳贻贝抗菌肽 Mytichitin-1 的全长 cDNA 克隆及序列分析  102-119
  3.1 材料与方法  102-107
    3.1.1 动物与试剂  102-103
    3.1.2 厚壳贻贝抗菌肽 Mytichitin-1 全长基因克隆  103-107
  3.2 实验结果  107-117
    3.2.1 贻贝性腺总 RNA 的提取  107-108
    3.2.2 贻贝 Mytichitin-1 基因的 5'RACE  108-109
    3.2.3 贻贝 Mytichitin-1 的序列分析  109-113
    3.2.4 Mytichitin-1 的亚细胞定位及信号肽预测  113-114
    3.2.5 Mytichitin-1 的序列比对及进化树分析  114-117
  3.3 讨论  117-119
参考文献  119-128
在读期间发表的学术论文及研究成果  128-129
致谢  129

厚壳贻贝特殊活性蛋白的结构与功能研究

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