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猪传染性胃肠炎抗体金标检测试纸的初步研制

作　者: 汪洋阳
导　师: 黄小波
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪传染性胃肠炎病毒胶体金免疫层析技术试纸条检测建立
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

猪传染性胃肠炎(TGE)是由传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起猪的一种高度接触性肠道传染病,主要以仔猪呕吐、腹泻和脱水为特征,给养猪业造成了严重的经济损失。快速诊断与监测是防控本病的关键技术之一,本研究运用胶体金免疫层析技术,对TGE抗体快速检测试纸条的可行性进行了初步的探索研究。本研究以三种方法制备了检测用抗原：以ST细胞培养TGEV病毒,并以蔗糖密度梯度离心法纯化病毒,纯化病毒含量为1.9mg/ml,TCID50=10-2.45/ml;以前期构建的原核载体pET-32a-SBC(表达S基因B、C抗原位点)和pET-32a-N(表达完整的N基因),在大肠杆菌中原核表达了SBC蛋白和N蛋白,并用镍离子亲和层析法纯化获得两种蛋白抗原,经SDS-PAGE鉴定其纯度和大小,结果检测到蛋白分子量分别约为38KDa和67KDa,Western blot表明N蛋白和SBC蛋白可与TGEV参考阳性血清反应(以纯化的SBC蛋白、PEDV-TGEV二联灭活苗和PEDV-TGEV-PRV三联弱毒苗免疫猪制备的阳性血清),纯化的蛋白具有良好的反应原性。免疫试纸条的初步研制与评价：本研究对金颗粒的制备、标记与金标试纸的最佳制备条件等进行了优化选择。利用柠檬酸三钠还原法制备直径20nm的胶体金颗粒,肉眼观察可见胶体金溶液为酒红色,透明澄清,电镜扫描观察金颗粒分布均匀、大小均一,以紫外分光光度计扫描观察到所制备的胶体金溶液最大吸收峰波长为522nm,且峰宽较小,胶体金颗粒分布较均匀。结果表明胶体金溶液的最佳制备条件为：100m10.01%氯金酸溶液中加入1.8m1的1%柠檬酸三钠,制备的金颗粒最佳,可用于标记蛋白。根据胶体金免疫层析技术原理,使用的样品垫预处理液为pH7.4的含0.05%Tween-20的0.5M PB；金标垫预处理液为5%蔗糖溶液；NC膜预处理液为磷酸盐缓冲液(PBS)；金标蛋白稀释液为0.02M pH7.4TBS(含1%BSA、2.5%蔗糖、2%PEG6000)和0.02MpH7.4PB(含1%BSA、2.5%蔗糖、1%PEG6000);封闭液为pH7.4的含1%BSA、1%Tween-20、2.5%蔗糖的0.01MPBS。分别用纯化后的TGEV病毒、N蛋白和SBC蛋白作为检测线(T线)的捕获抗原,鸡抗SPA IgG作为质控线(C线),胶体金标记葡萄球菌A蛋白(SPA)做金标垫,并对其最佳工作条件进行选择。结果表明：金标SPA蛋白最佳标记量为25ug/ml,最适pH值为6.5；金标SPA蛋白稀释浓度为1：1；三种抗原以提纯的TGEV病毒为最佳,选择病毒为T线包被抗原浓度为0.7mg/ml;C线最佳划线浓度为1.5mg/ml。研制的试纸条能与三种自制的TGEV制阳性血清和标准阳性血清反应,不与猪流行性腹泻(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙脑病毒(JEV)等病原的阳性血清反应。该方法简单、快速,可在6分钟左右出结果。本方法初步研究表明以免疫层析技术构建TGE抗体检测试纸是可行的,后续进一步完善后组装成快速检测卡将有较好的应用前景。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-9
缩写说明  9-10
目录  10-14
第一部分文献综述  14-24
  1 TGEV病原学特性及研究进展  14-17
    1.1 TGEV的形态学特征  14
    1.2 TGEV的培养特性  14-15
    1.3 TGEV理化特性  15
    1.4 TGEV分子生物学特性  15-17
      1.4.1 TGEV的基因构成  15
      1.4.2 TGEV的蛋白结构与功能  15-17
  2 TGEV的流行病学与致病机理  17
  3 TGEV的诊断方法  17-19
    3.1 TGEV传统诊断方法  17-18
      3.1.1 TGEV病毒的分离、鉴定  17
      3.1.2 病毒的电镜检测  17-18
      3.1.3 病毒抗原血清学检测  18
      3.1.4 抗体血清学检测  18
    3.2 分子生物学诊断方法  18-19
      3.2.1 RT-PCR检测方法  18-19
      3.2.2 核酸探针杂交技术检测  19
  4 免疫胶体金技术的研究进展  19-23
    4.1 免疫胶体金标记技术  19-21
      4.1.1 免疫胶体金技术的原理  20
      4.1.2 胶体金的制备  20
      4.1.3 胶体金质量的鉴定  20
      4.1.4 胶体金颗粒直径的选择  20-21
      4.1.5 免疫胶体金的标记  21
    4.2 免疫胶体金技术在诊断中的应用  21-22
      4.2.1 胶体金在光镜水平的应用  21-22
      4.2.2 胶体金在电镜水平的应用  22
      4.2.3 凝集试验  22
    4.3 免疫胶体金快速检测技术在兽医领域的研究进展  22-23
  5 研究目的与意义  23-24
第二部分试验部分  24-60
  1 试验材料  24-26
    1.1 菌株、疫苗、细胞和病毒  24
    1.2 主要试剂及配制  24
    1.3 试剂配制  24-25
      1.3.1 蛋白表达纯化主要试剂  24-25
      1.3.2 胶体金试纸条主要试剂  25
      1.3.3 试纸条材料  25
    1.4 主要仪器设备  25-26
  2 方法  26-39
    2.1 三种检测抗原的制备  26-33
      2.1.1 TGEV N蛋白、S_(BC)蛋白的表达、纯化与鉴定  26-30
      2.1.2 TGEV的培养、纯化与鉴定  30-33
    2.2 TGEV阳性血清的制备  33-34
      2.2.1 猪的免疫  33-34
    2.3 免疫胶体金的制备  34-35
      2.3.1 玻璃器皿的清洁  34
      2.3.2 胶体金的制备  34
      2.3.3 胶体金溶液的质量鉴定  34-35
    2.4 金标蛋白的制备  35-36
      2.4.1 免疫胶体金标记最适pH值的测定  35
      2.4.2 免疫胶体金标记最佳蛋白浓度的确定  35
      2.4.3 金标抗体的大量标记以及分离纯化  35-36
    2.5 免疫胶体金试纸条的制备  36-38
      2.5.1 试纸条反应条件的优化  36-37
      2.5.2 试纸条材料的预处理  37
      2.5.3 金标试纸的制备  37
      2.5.4 NC膜包被浓度的优化  37-38
    2.6 试纸条的组装与检测  38-39
    2.7 试纸条性能研究  39
      2.7.1 敏感性试验  39
      2.7.2 特异性试验  39
      2.7.3 重复性试验  39
  3 结果  39-54
    3.1 抗原的制备与纯化  39-43
      3.1.1 TGEV N蛋白、S_(BC)蛋白的表达与纯化  39-42
      3.1.2 TGEV的培养、纯化及毒力测定结果  42-43
    3.2 猪抗血清制备  43-44
    3.3 胶体金质量的鉴定  44-47
      3.3.1 柠檬酸三钠最佳添加量的确定  44-46
      3.3.2 不同柠檬酸三钠添加量胶体金溶液颜色变化  46-47
    3.4 免疫胶体金试纸条的制备  47-53
      3.4.1 稳定胶体金最佳pH的选择  47
      3.4.2 稳定胶体金最适抗体蛋白用量的选择  47-48
      3.4.3 胶体金标记抗体的鉴定  48-49
      3.4.4 试纸条反应条件的优化  49-53
    3.5 免疫胶体金试纸条的测试  53-54
      3.5.1 敏感性试验  53
      3.5.2 特异性试验  53-54
      3.5.3 重复性试验  54
    3.6 试纸条的组装  54
  4. 讨论  54-59
    4.1 三种抗原的纯化  54-55
    4.2 三种检测抗原效果的分析  55
    4.3 阳性血清的制备  55-56
    4.4 关于免疫胶体金诊断试纸的组装制备  56-59
      4.4.1 胶体金溶液的制备  56
      4.4.2 影响胶体金标记蛋白的因素  56-57
      4.4.3 层析膜的选择  57-58
      4.4.4 T线和C线的优化  58
      4.4.5 影响检测灵敏性的因素  58-59
    4.5 本研究的不足与后续研究建议  59
  5. 结论  59-60
参考文献  60-65
致谢  65-66
附录  66-68

猪传染性胃肠炎抗体金标检测试纸的初步研制

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