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秦川牛PPARGC1A基因功能验证及遗传变异研究

作　者: 李密杰
导　师: 陈宏
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 遗传学
关键词: 秦川牛 PPARGC1A基因功能验证遗传变异
分类号: S823
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator1alpha, PPARGC1A or PGC-1α),编码基因为PPARGC1A,作为转录共激活因子可以与一系列的转录因子相互作用,参与多种代谢途径,如适应性产热、线粒体的生物合成、葡萄糖代谢、肝脏糖异生、脂肪酸p氧化、脂肪细胞分化、肌肉类型转换等。在动物遗传育种中,由于PPARGC1A参与机体能量平衡和脂肪代谢调控的相关过程,PPARGC1A基因被作为影响动物产乳特性、肉质品质和动物生长的侯选基因加以研究,目前未发现该基因在中国地方黄牛品种中的相关研究。为此本研究利用基因克隆,腺病毒载体构建,细胞培养,qPCR,荧光素酶活性测定,DNA池测序,PCR-SSCP及PCR-RFLP等技术开展了秦川牛PPARGC1A基因的克隆,腺病毒介导的过表达和干扰技术对该基因的表达调控,及其在调控线粒体氧化呼吸链相关基因和肌肉细胞增殖分化相关基因的功能验证,启动子区的克隆及核心启动区的筛选分析,基因遗传变异的扫描及其与生长性状的关联分析等工作,以期为该基因在中国地方黄牛育种中的应用提供基础科学依据,主要获得了如下结果：1.克隆了秦川牛PPARGC1A基因CDS区,全长2391bp,编码796个氨基酸。并构建了腺病毒介导的过表达秦川牛PPARGC1A基因的载体Ad-PPARGC1A, TCID50法测得滴度为6×109PFU/mL,感染牛肌肉细胞的最佳MOI为150μL。Ad-PPARGC1A腺病毒感染牛肌肉细胞后,验证了PPARGC1A可促进线粒体氧化呼吸链相关基因的表达,并可促进牛肌肉细胞在含20%胎牛血清培养基中的增殖相关基因的表达及在含2%马血清培养基中的分化相关基因的表达。2.利用在线软件设计了针对牛PPARGC1A基因的3条shRNAs (shRNA-574、 shRNA-749、shRNA-1013),并通过实验筛选出shRNA-574和shRNA-749序列的干扰效果较明显。构建了针对牛PPARGC1A基因的Ad-shRNA-574和Ad-shRNA-749干扰腺病毒载体,TCID50法测得滴度分别为：3×109PFU/mL和8×108PFU/mL,感染牛肌肉细胞的最佳MOI均为200μL。干扰腺病毒Ad-shRNA574和Ad-shRNA749感染牛肌肉细胞后,在含2%马血清的分化培养基中的干扰效果较明显,干扰效率分别为41%和51%。干扰牛PPARGC1A基因后,牛肌肉细胞中的线粒体氧化呼吸链相关基因的表达量降低,同时影响肌肉细胞的正常增殖和分化相关基因的表达。3.克隆了秦川牛PPARGC1A基因启动子区2119bp片段,包括起始密码子上游-2072bp至下游+47bp处区域。构建了包含秦川牛PPARGC1A基因启动子区不同截短体的重组载体pGL3-Basic-Promoter,通过荧光素酶活性测定检测不同片段的相对启动活性并结合软件预测结果,推测该基因的启动子活性区在-2072bp至-2001bp之间。4.经DNA池测序扫描后发现牛PPARGC1A基因20处多态位点,其中位于该基因外显子和内含子区的有13处：g.64897G>A, g.72175A>G, g.72202A>G, g.84063T>C, g.84163G>A, g.85272C>T, g.85329C>T, g.85352C>T, g.85400A>G, g.85442G>A, g.85540C>T, g.85609T>C, g.85631T>G;位于基因启动子区的有7处：SNP-259T>A,-301_-298insCTTT,-915A>G,-1175T>G,-1590C>T,-1665C>T和-1690G>A。与中国部分黄牛生长性状关联分析后发现：SNP g.64897G>A与南阳牛24月龄体重和日增重相关,且GG基因型为优势基因型。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-14
第一章文献综述  14-26
  1.1 PPARGC1A基因研究进展  14-23
    1.1.1 PPARGC1A基因结构  14-16
    1.1.2 PPARGC1A基因的生理功能  16-21
    1.1.3 PPARGC1A基因在人类中的多态性研究  21-22
    1.1.4 PPARGC1A基因在畜禽上的研究进展  22-23
  1.2 腺病毒载体的研究进展  23-25
    1.2.1 腺病毒生物学特性  23-24
    1.2.2 腺病毒载体的发展  24-25
  1.3 展望  25-26
第二章秦川牛PPARGC1A基因克隆、过表达腺病毒载体的构建及功能验证  26-46
  2.1 材料与方法  26-33
    2.1.1 试验材料与主要试剂  26
    2.1.2 引物设计  26
    2.1.3 RNA的提取和cDNA的合成  26-27
    2.1.4 秦川牛PPARGC1A基因CDS区克隆  27
    2.1.5 pGMT-PPARGC1A载体构建  27-28
    2.1.6 pAdTrack-CMV-PPARGC1A载体的构建  28-29
    2.1.7 pAdeasy-1-CMV-PPARGC1A载体的构建  29-30
    2.1.8 腺病毒Ad-PPARGC1A的包装  30-31
    2.1.9 腺病毒Ad-PPARGC1A的收获及扩增  31
    2.1.10 腺病毒Ad-PPARGC1A滴度的测定  31
    2.1.11 最佳MOI(Multiplicity of Infection)的确定  31
    2.1.12 PPARGC1A基因过表达对牛肌肉细胞代谢和分化基因表达的影响  31-33
  2.2 结果与分析  33-42
    2.2.1 RNA提取  33-34
    2.2.2 秦川牛PPARGC1A基因CDS区克隆及pGMT-PPARGC1A载体构建  34-36
    2.2.3 pAdTrack-CMV-PPARGC1A载体的构建  36-37
    2.2.4 pAdeasy-1-CMV-PPARGC1A载体的构建  37
    2.2.5 腺病毒Ad-PPARGC1A的包装  37-38
    2.2.6 腺病毒Ad-PPARGC1A的扩增及滴度测定  38-39
    2.2.7 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的确定  39
    2.2.8 PPARGC1A基因过表达后对牛肌肉细胞代谢和分化相关基因的影响  39-42
  2.3 讨论  42-45
    2.3.1 腺病毒介导的基因过表达  42-43
    2.3.2 PPARGC1A基因过表达对牛肌肉细胞相关基因的影响  43-45
  2.4 小结  45-46
第三章秦川牛PPARGC1A基因干扰腺病毒载体的构建及功能验证  46-63
  3.1 材料与方法  46-53
    3.1.1 试验材料与主要试剂  46
    3.1.2 靶向PPARGC1A基因的shRNAs干扰序列的设计及合成  46-48
    3.1.3 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNAs载体的构建  48-49
    3.1.4 pDsRed1-C1-PPARGC1A表达载体的构建  49-50
    3.1.5 有效shRNAs序列的筛选  50-51
    3.1.6 pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNAs重组腺病毒载体的构建及鉴定  51-52
    3.1.7 腺病毒的包装、扩增及滴度测定  52
    3.1.8 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的确定  52
    3.1.9 PPARGC1A基因沉默后对肌肉细胞代谢和分化相关基因表达的影响  52-53
  3.2 结果与分析  53-60
    3.2.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNAs载体的构建  53
    3.2.2 pDsRed1-C1-PPARGC1A载体的构建  53-54
    3.2.3 有效shRNAs序列的筛选  54-55
    3.2.4 pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNAs重组腺病毒骨架载体的构建  55-56
    3.2.5 腺病毒的包装、扩增及滴度测定  56-57
    3.2.6 最佳MOI(Multiplicity Of Infection)的确定  57
    3.2.7 PPARGC1A基因沉默后对肌肉细胞代谢和分化相关基因表达的影响  57-60
  3.3 讨论  60-62
    3.3.1 腺病毒载体介导的RNAi  60-61
    3.3.2 干扰腺病毒对牛肌肉细胞代谢和增殖分化相关基因的影响  61-62
  3.4 小结  62-63
第四章秦川牛PPARGC1A基因启动子区的克隆及活性研究  63-77
  4.1 材料与方法  63-68
    4.1.1 试验材料与主要试剂  63
    4.1.2 引物设计与合成  63
    4.1.3 秦川牛全血DNA的提取  63-64
    4.1.4 秦川牛PPARGC1A基因启动子区全长扩增  64
    4.1.5 pGMT-Promoter载体的构建  64-65
    4.1.6 pGL3-Basic-Promoter不同截短载体的构建  65-67
    4.1.7 pRL-TK和pGL3-Control载体的扩增与纯化  67
    4.1.8 HEK293和C2C12细胞的培养  67
    4.1.9 pGL3-Basic-Promoter重组系列质粒与对照质粒pR-TK共转染HEK293和C2C12细胞  67-68
    4.1.10 荧光素酶活性检测  68
  4.2 结果与分析  68-75
    4.2.1 秦川牛PPARGC1A基因启动子区全长扩增  68
    4.2.2 pGMT-Promoter载体的构建  68-70
    4.2.3 pGL3-Basic-Promoter不同截短载体的构建  70-72
    4.2.4 荧光素酶活性检测  72-75
  4.3 讨论  75-76
    4.3.1 秦川牛PPARGC1A基因启动子活性在HEK293及C2C12细胞系中的差异  75
    4.3.2 秦川牛PPARGC1A基因启动子不同截短体的活性差异  75-76
  4.4 小结  76-77
第五章牛PPARGC1A基因遗传变异及其与生长性状的关联分析  77-95
  5.1 材料与方法  77-81
    5.1.1 实验动物与主要试剂  77-78
    5.1.2 血液样品中基因组DNA提取  78
    5.1.3 引物设计及PCR反应  78-80
    5.1.4 利用DNA池技术扫描SNPs  80
    5.1.5 利用PCR-SSCP和PCR-RFLP检测突变在群体中的分布规律  80
    5.1.6 数据统计分析模型  80-81
  5.2 结果与分析  81-93
    5.2.1 牛血液样品中基因组DNA的提取  81
    5.2.2 PCR扩增结果  81-83
    5.2.3 DNA池扫描SNPs  83-87
    5.2.4 不同SNPs分型结果  87-89
    5.2.5 PPARGC1A基因多态位点频率分布的群体遗传学分析  89-92
    5.2.6 PPARGC1A基因SNPs与牛生长性状的关联分析  92-93
  5.3 讨论  93-94
    5.3.1 PPARGC1A基因多态性在中国地方牛品种与外国牛品种的比较  93
    5.3.2 牛PPARGC1A基因多态性与生长性状之间的关联  93-94
  5.4 小结  94-95
第六章结论与创新点  95-96
  6.1 结论  95
  6.2 创新点  95-96
参考文献  96-105
附录  105-118
致谢  118-119
作者简介  119-120

秦川牛PPARGC1A基因功能验证及遗传变异研究

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