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牦牛Sertoli细胞的纯化培养与生物学特性研究

作　者: 张华
导　师: 余四九
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 牦牛 Sertoli细胞 细胞培养 生物学特性
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 5次
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内容摘要


本实验通过两步酶震荡消化法分离培养牦牛Sertoli细胞，低渗处理以及饥饿处理来纯化培养Sertoli细胞，以便研究Sertoli细胞的体外生长动力学和生物学特性，为在细胞水平上研究雄性牦牛生殖生理功能的调控机制奠定基础，同时为牦牛体细胞克隆技术提供饲养层细胞和核供体。以5月龄牦牛睾丸组织为材料，进行试验，获得如下结果：体视显微镜下机械分离曲细精管，采用1g/LⅠ型胶原酶-透明质酸酶和0.25%胰蛋白酶两步酶消化法分离培养了原代牦牛Sertoli细胞。发现细胞培养5h后更换基本培养基可以除去大部分未贴壁的生精细胞。培养24h后经20mmol/L Tris-HC1缓冲液低渗5min，贴壁的生精细胞胀破脱壁。加入无血清培养基继续培养1周后得到纯化的牦牛Sertoli细胞，其胞体伸展，形态高度不规则，两侧多有突起。液氮冷冻保存纯化后的牦牛Sertoli细胞3个月，复苏前后检测其活力。发现冷冻前细胞活力为97%，解冻复苏后的活力为94.5%。复苏后的细胞形态和生长状态良好，表明液氮冷冻保存技术对Sertoli细胞的生存能力影响较小。从长远来看利用液氮冷冻保存技术来保存牦牛基因资源从而实现物种保护的目的是可行的。牦牛Sertoli细胞的生长趋向于“S”型曲线，第1天细胞处于停滞期，第2天开始进入到指数生长期阶段。 Feulgen染色技术鉴别证实，牦牛Sertoli细胞的核周围存在卫星核小体；免疫细胞化学技术表明，牦牛Sertoli细胞FasL阳性表达；染色体分析复苏后的牦牛Sertoli细胞符合正常的染色体组数60条，包含29对常染色体和1对性染色体。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章 文献综述  9-21
  1 Sertoli 细胞的结构  9-11
  2 Sertoli 细胞的功能  11-16
    2.1 Sertoli 细胞的作用  11-12
      2.1.1 Sertoli 细胞对生精细胞的作用  11-12
      2.1.2 Sertoli 细胞对间质细胞的作用  12
      2.1.3 Sertoli 细胞对肌样细胞的作用  12
    2.2 Sertoli 细胞的分泌功能  12-15
      2.2.1 转运蛋白类  13
      2.2.2 调节蛋白类  13-14
      2.2.3 生长因子类  14
      2.2.4 类固醇类  14-15
      2.2.5 其他  15
    2.3 血-睾屏障  15
    2.4 Sertoli 细胞的免疫豁免作用  15-16
  3 Sertoli 细胞体外培养研究进展  16-21
    3.1 Sertoli 细胞体外培养  16-18
      3.1.1 Sertoli 细胞分离培养  16-18
      3.1.2 制作饲养层  18
      3.1.3 Sertoli 细胞促细胞生长  18
      3.1.4 Sertoli 细胞在动物克隆中的应用  18
    3.2 Sertoli 细胞的双室培养  18-19
    3.4 永生株的建立  19
    3.5 Sertoli 细胞免疫抑制作用的应用  19-21
第二章 牦牛 Sertoli 细胞的纯化培养  21-39
  实验一 牦牛 Sertoli 细胞的分离培养  21-31
    1 实验材料  21-23
      1.1 动物样品采集  21
      1.2 仪器设备  21-22
      1.3 主要试剂  22
      1.4 主要试剂的配制  22-23
    2 实验方法  23-25
      2.1 牦牛睾丸样品的采集与处理  23
      2.2 牦牛 Sertoli 细胞的原代培养  23-24
      2.3 牦牛 Sertoli 细胞的分离与纯化  24
      2.4 细胞形态观察  24
      2.5 牦牛 Sertoli 细胞的传代培养  24-25
      2.6 牦牛 Sertoli 细胞的冻存与复苏  25
        2.6.1 细胞冻存步骤  25
        2.6.2 细胞解冻复苏步骤  25
    3 结果与分析  25-28
      3.1 牦牛 Sertoli 细胞体外培养的形态学观察  25
      3.2 牦牛 Sertoli 细胞的纯化培养  25-26
      3.3 牦牛 Sertoli 细胞的传代培养  26-27
      3.4 牦牛 Sertoli 细胞的液氮冻存前后的活力检测  27-28
    4 讨论  28-31
      4.1 牦牛 Sertoli 细胞原代培养  28-29
      4.2 牦牛 Sertoli 细胞纯化培养  29
      4.3 牦牛 Sertoli 细胞传代培养  29
      4.4 牦牛 Sertoli 细胞的冻存与复苏  29-31
  实验二 牦牛 Sertoli 细胞的鉴定与生物学特性研究  31-39
    1 试验材料  31-32
      1.1 样品来源  31
      1.2 主要试剂  31
      1.3 主要试剂的配制  31-32
    2 试验方法  32-34
      2.1 牦牛 Sertoli 细胞生长曲线的绘制  32
      2.2 牦牛 Sertoli 细胞 Feulgen 染色鉴定  32
      2.3 牦牛 Sertoli 细胞免疫细胞化学鉴定  32-33
      2.4 牦牛 Sertoli 细胞的核型分析  33-34
        2.4.1 染色体标本制作  33
        2.4.2 核型结果分析方法  33-34
      2.5 微生物污染检测  34
        2.5.1 细菌、真菌检测  34
        2.5.2 病毒检测  34
        2.5.3 支原体检测  34
    3 结果与分析  34-38
      3.1 牦牛 Sertoli 细胞体外培养生长特性  34-35
      3.2 牦牛 Sertoli 细胞 Feulgen 染色  35-36
      3.3 牦牛 Sertoli 细胞免疫细胞化学鉴定  36
      3.4 牦牛 Sertoli 细胞的核型分析  36
      3.5 微生物污染检测结果  36-38
        3.5.1 细菌和真菌检测  36-37
        3.5.2 病毒检测  37
        3.5.3 支原体检测  37-38
    4 讨论  38-39
      4.1 牦牛 Sertoli 细胞 Feulgen 染色  38
      4.2 牦牛 Sertoli 细胞的核型分析  38-39
结论  39-40
参考文献  40-47
致谢  47-48
个人简介  48-49
导师简介  49-51

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 牛
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