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东北矮紫杉组织培养过程中紫杉醇及生物合成中间物的积累规律研究

作　者: 何冬云
导　师: 张宗申
学　校: 大连工业大学
专　业: 发酵工程
关键词: 东北矮紫杉愈伤组织紫杉醇 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ
分类号: S791.49
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文以东北矮紫杉幼茎为外植体，研究了培养基成分、培养条件、氨基酸和诱导子等因素对愈伤组织培养物生长、次生代谢产物和重要中间化合物积累的影响，优化出适合东北矮紫杉愈伤组织生长的培养条件，本结果为通过细胞工程手段大规模培养提取紫杉醇的原材料提供了基础数据。结果如下：1东北矮紫杉幼茎愈伤组织诱导的最适培养基为：B5+2,4-D0.5mg·L^-1+NAA1.5mg·L^-1；温度为24℃，黑暗培养。B5+NAA1.0mg·L^-1+6-BA0.2mg·L^-1+2,4-D1.5mg·L^-1为愈伤组织生长的最佳增殖培养基；温度为24℃，黑暗培养。愈伤组织的生长周期在22～24d左右，生长曲线呈“S”型。2东北矮紫杉愈伤组织中紫杉醇积累的最佳培养基为：B5+NAA1.0mg·L^-1+6-BA0.1mg·L^-1+2,4-D2.0mg·L^-1，其中30g·L^-1蔗糖，混合氮源(总浓度为32mmol·L^-1)，NO-3∶NH₄⁺比例为（30∶2），1.25mmol·L^-1NaH₂PO₄，1.02mmol·L^-1CaCl₂，培养温度为24℃，培养后期经光照强度Ⅱ（4600lx），照射时间为12h·d^-1。重要中间化合物10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-DAB）积累的最佳培养基：B5+NAA1.5mg·L^-1+6-BA0.2mg·L^-1+2,4-D2.0mg·L^-1，其中蔗糖为50g·L^-1，NO-3∶NH₄⁺比例为（24∶8），NaH₂PO₄1.25mmol·L^-1，0.51mmol·L^-1CaCl₂，24℃，培养后期光照强度Ⅰ（1900lx），照射时间为4h·d^-1。3不同种类和浓度的氨基酸对东北矮紫杉愈伤组织生长、紫杉醇和10-DAB积累具有一定的的影响。其中添加1mmol·L^-1的谷氨酸，显著提高了紫杉醇的含量和产量，其含量和产量分别为193μg·g^-1、3.4412mg·L^-1，是对照组的2.02倍和2.44倍；添加1mmol·L^-1的苯丙氨酸对10-DAB的积累效果最好，其含量和产量分别为290μg·g^-1、6.1023mg·L^-1，是对照组的1.4倍和2.7倍。4在培养基中添加诱导子对愈伤组织生长、紫杉醇和10-DAB积累有很大影响。培养后期30min·d^-1的365nm紫外线照射使紫杉醇的含量和产量达到最大值为129μg·g^-1、1.6838mg·L^-1，分别为对照组的1.35倍、1.19倍，10-DAB的含量和产量于10min·d^-1的紫外线照射下达到最大值为199.4μg·g^-1、2.4684mg·L^-1，为对照组的1.34倍、1.13倍；草酸对紫杉醇和10-DAB的合成和积累均有促进作用，其中0.1mmol·L^-1草酸处理的紫杉醇含量和产量达到153μg·g^-1、2.3199mg·L^-1，分别是对照组的1.60倍、1.64倍，0.05mmol·L^-1的草酸处理10-DAB含量和产量达到209μg·g^-1、3.4044mg·L^-1，为对照组的1.41倍和1.55倍；水杨酸处理对愈伤组织细胞产生毒害作用，但对紫杉醇的合成具有促进作用，对10-DAB的合成具有抑制作用；0.05mmol·L^-1的过氧化氢处理愈伤组织中紫杉醇和10-DAB产量达到1.9115mg·L^-1、3.3492mg·L^-1，为对照组的1.35倍、1.53倍。5培养基中添加活性炭、抗坏血酸和聚乙烯吡咯烷酮对愈伤组织的褐变具有一定程度的抑制作用，其中添加50mg·L^-1抗坏血酸时，抑制愈伤组织褐变的效果最佳。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章文献综述  12-27
  1.1 红豆杉  12-14
    1.1.1 红豆杉资源概况  12-13
    1.1.2 东北矮紫杉资源概况  13-14
  1.2 红豆杉属植物的化学成分及药理作用  14-19
    1.2.1 紫杉醇的结构与性质  14-15
    1.2.2 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的结构与性质  15-16
    1.2.3 紫杉醇的作用机理  16
    1.2.4 紫杉醇的临床应用  16-17
    1.2.5 紫杉醇和 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的药源来源  17-19
  1.3 红豆杉细胞组织培养  19-26
    1.3.1 外植体的选择  21
    1.3.2 培养基种类和培养基成分  21-25
      1.3.2.1 培养基种类  21-22
      1.3.2.2 碳源  22
      1.3.2.3 氮源  22
      1.3.2.4 磷源  22-23
      1.3.2.5 钙源  23
      1.3.2.6 植物生长调节剂  23
      1.3.2.7 添加诱导子  23-24
      1.3.2.8 添加前体物质  24-25
    1.3.3 培养条件  25-26
      1.3.3.1 温度  25
      1.3.3.2 光照  25
      1.3.3.3 pH 值  25
      1.3.3.4 接种量  25-26
  1.4 褐变问题  26
  1.5 本研究的目的和意义  26-27
第二章材料与方法  27-35
  2.1 试验材料  27
  2.2 实验主要仪器  27
  2.3 实验试剂  27-28
  2.4 实验方法  28-32
    2.4.1 愈伤组织的诱导和增殖培养  28-29
      2.4.1.1 愈伤组织的诱导  28
      2.4.1.2 愈伤组织的增殖继代  28
      2.4.1.3 愈伤组织的生长曲线测定  28-29
    2.4.2 植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响  29
    2.4.3 植物生长调节剂对愈伤组织增殖、紫杉醇和 10-DAB 合成的影响  29
    2.4.4 基础培养基对愈伤组织生长、紫杉醇和 10-DAB 合成的影响  29
    2.4.5 培养基条件对愈伤组织生长、紫杉醇和 10-DAB 积累的影响  29-30
    2.4.6 培养基成分对愈伤组织生长、紫杉醇和 10-DAB 合成的影响  30
    2.4.7 氨基酸对愈伤组织生长、紫杉醇和 10-DAB 合成的影响  30-31
    2.4.8 诱导子对愈伤组织生长、紫杉醇和 10-DAB 合成的影响  31
    2.4.9 东北矮紫杉愈伤组织培养过程中褐变问题的解决  31-32
  2.5 分析方法  32-35
    2.5.1 东北矮紫杉愈伤组织指标和生理生化指标的测定  32
    2.5.2 紫杉醇含量和 10-DAB 含量的测定  32-34
      2.5.2.1 样品中紫杉醇的提取  32
      2.5.2.2 HPLC 法测定紫杉醇的含量  32-33
      2.5.2.3 样品中 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的提取  33
      2.5.2.4 HPLC 法测定 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量  33-34
    2.5.3 多酚氧化酶（PPO）的活性测定和褐变等级的标准  34-35
第三章结果与讨论  35-61
  3.1 愈伤组织的诱导  35-36
  3.2 东北矮紫杉愈伤组织的增殖  36-37
  3.3 东北矮紫杉愈伤组织的生长周期  37-38
  3.4 东北矮紫杉愈伤组织中紫杉醇合成的调控  38-51
    3.4.1 植物生长调节剂对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  38
    3.4.2 温度对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  38-40
    3.4.3 光照对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  40-41
    3.4.4 不同基础培养基对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  41
    3.4.5 碳源对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  41-43
    3.4.6 氮源对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  43
    3.4.7 不同浓度磷酸盐对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  43-44
    3.4.8 不同浓度钙盐对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  44
    3.4.9 氨基酸对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  44-46
      3.4.9.1 不同氨基酸 1 mmol·L~(-1)对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  44-45
      3.4.9.2 不同氨基酸 0.5 mmol·L~(-1)对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  45-46
    3.4.10 诱导子对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  46-51
      3.4.10.1 紫外照射对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  46-47
      3.4.10.2 草酸对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  47-49
      3.4.10.3 水杨酸对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  49-50
      3.4.10.4 过氧化氢对愈伤组织生长和紫杉醇合成的影响  50-51
  3.5 东北矮紫杉愈伤组织中 10-DAB 合成的调控  51-60
    3.5.1 植物生长调节剂对愈伤组织生长和 10-DAB 合成的影响  51
    3.5.2 温度对愈伤组织 10-DAB 合成的动态影响  51-52
    3.5.3 光照对愈伤组织 10-DAB 合成的影响  52-53
    3.5.4 不同基础培养基对愈伤组织 10-DAB 合成的影响  53
    3.5.5 不同碳源对愈伤组织生长和 10-DAB 合成的影响  53-54
    3.5.6 氮源对愈伤组织生长和 10-DAB 合成的影响  54-55
    3.5.7 不同浓度磷酸盐对愈伤组织生长和 10-DAB 合成的影响  55
    3.5.8 不同浓度钙盐对愈伤组织生长和 10-DAB 合成的影响  55-56
    3.5.9 氨基酸对愈伤组织中 10-DAB 合成的影响  56-57
      3.5.9.1 不同氨基酸 1 mmol·L~(-1)对 10-DAB 合成的影响  56-57
      3.5.9.2 不同氨基酸 0.5 mmol·L~(-1)对 10-DAB 合成的影响  57
    3.5.10 诱导子对愈伤组织 10-DAB 合成的影响  57-60
      3.5.10.1 紫外照射对愈伤组织 10-DAB 合成的影响  57-58
      3.5.10.2 草酸对愈伤组织 10-DAB 合成的影响  58
      3.5.10.3 水杨酸对愈伤组织 10-DAB 合成的影响  58-59
      3.5.10.4 过氧化氢对愈伤组织 10-DAB 合成的影响  59-60
  3.6 褐变问题  60-61
第四章结论  61-63
参考文献  63-67
致谢  67

东北矮紫杉组织培养过程中紫杉醇及生物合成中间物的积累规律研究

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