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铜胁迫下凤丹和观赏牡丹的生理反应及凤丹转录组分析

作　者: 董春兰
导　师: 徐迎春
学　校: 南京农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 凤丹观赏牡丹高通量测序铜胁迫转录组
分类号: S567.19
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

凤丹(Paeonia ostii)为原产于安徽铜陵凤凰山地区的药用牡丹种类(其根皮(凤丹皮)为著名的地道药材),同时兼具较高的观赏价值。凤丹根系发达,抗逆性强,在生产上常被用作观赏牡丹嫁接育苗的优良砧木。前人和我们的研究发现,凤丹在安徽铜陵铜尾矿地区生长良好,丹皮产量高,品质好,说明凤丹在铜污染土壤上具有较强的适应能力。为揭示凤丹的耐铜机理,本研究通过考察凤丹在铜胁迫下生长和生理反应,以揭示凤丹耐铜生理机理,并在此基础上,分析铜胁迫下凤丹转录组的变化规律,寻找凤丹体内响应铜胁迫的基因,从而初步揭示凤丹耐铜的分子机制,为利用凤丹对铜污染土壤进行修复与开发利用提供科学依据。另一方面,鉴于凤丹常用作观赏牡丹嫁接育苗的砧木,为研究牡丹嫁接后是否具有与凤丹相似的耐铜性,本研究以‘肉芙蓉’牡丹嫁接苗为试材,考察了观赏牡丹在铜胁迫下的生理反应,为拓宽牡丹种植范围,尝试将牡丹种植于铜污染土壤上,达到既吸附铜降低铜污染,又美化环境目的提供理论依据。1.铜胁迫对凤丹生长及生理特性的影响采用盆栽法,研究凤丹在不同浓度(0,300mg·kg-1,600mg·kg-1,900mg·kg-1,1200mg·kg-1)铜处理下的反应,结果表明：铜处理对凤丹生长无显著抑制作用；300mg·kg-1铜处理能促进株高和新枝长度的增加；600mg·kg-1铜处理对根颈加粗和主根的伸长有促进作用。叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量在≤600mg·kg-1铜处理下不受影响,叶片中SOD活性受1200mg·kg-1铜处理诱导升高。根系中的SOD以及叶和根中的POD活性在铜胁迫下均呈现先升后降的趋势。MDA含量仅在1200mg·kg-1铜处理下的根中发生显著升高。铜主要分布在根部,地上部含量维持相对稳定。Ca和Mn含量完全不受铜胁迫的影响,叶片中K含量在600mg·kg-1和900mg·kg-1铜处理下显著降低,但600mg·kg-1铜处理下叶中Mg的积累量增加,铜浓度≥600mg·kg-1时叶中Zn的吸收显著受到抑制,铜处理可促进根系对Fe的吸收,但叶片中Fe含量受铜胁迫诱导显著下降。900和1200mg·kg-1铜处理下叶和茎中的P含量显著下降,而根部P的吸收在600mg·kg-1铜浓度下就已经开始出现显著下降。2.铜胁迫对观赏牡丹生长及抗氧化酶活性等生理特性的影响利用盆栽方法对以凤丹根为砧木嫁接的‘肉芙蓉’牡丹苗进行低(300mg·kg-1)、中(600mg·kg-1)、高(900mg·kg-1)三个浓度铜处理,研究其在不同铜处理下的生长、生理及元素吸收情况,结果表明：300和600mg·kg-1铜处理对植株大部分的形态指标无显著影响,600mg·kg-1铜处理促进根颈的增粗。不同浓度铜处理下叶绿素含量均无显著差异,但叶绿素a/b在600和900mg·kg-1铜处理下均显著下降。SOD活性受铜处理诱导升高,但900mg·kg-1铜处理下活性无显著变化。POD活性在铜胁迫下表现为300mg·kg-1铜浓度促进,600和900mg·kg-1浓度抑制。MDA含量在低铜处理下影响不显著,中高浓度下MDA含量出现上升趋势。植株通过根系滞留作用有效的将大部分铜离子控制在根部,使地上部的铜含量维持在较低水平。叶片中Zn含量在所有铜处理下均显著降低,根系对Zn的吸收仅受高浓度铜处理抑制。除此之外,所有铜处理均未对P、K、Ca、Mg、Fe及Mn在叶片和根系中的吸收产生抑制效应。3.凤丹转录组测序分析采用水培法,用100μM CuSO4对凤丹进行铜胁迫处理,分别于处理后1h、6h、12h、24h取对照(CK)和铜胁迫处理(copper)的凤丹的根、茎、叶,分别提取总RNA,然后等量混合,采用高通量测序技术对CK和copper两个转录组文库测序,结果表明,CK文库共获得clean reads53221924个,总长为4789973160bp,组装得到平均长度为300bp的Contig160071个,总长度为48014829bp,N50为496bp,最终拼接得到了平均长度为600bp的Unigene82302个,总长度为49382245bp,N50为985bp。Copper文库获得clean reads52068126个,总长为4686131340bp,组装得到平均长度为307bp的Contig144049个,总长度为44238621bp,N50为506bp,最终拼接得到了平均长度为580bp的Unigene77204个,总长度为44772914bp,N50为929bp。与Nr库比对后获得了45684个功能注释,在Swiss-Prot中得到了28821个注释。筛选到4324个差异表达的基因,其中有2207个表达量上调,2117个表达量下调,通过KEGG绘制出了118条代谢路径,在这些路径中表达量发生明显变化的基因,在凤丹响应铜胁迫过程中发挥着重要的调控作用。铜胁迫下,凤丹体内大部分多铜氧化酶基因和金属硫蛋白基因表达量增加,ZIP家族和ABC家族中的某些成员受铜刺激出现强烈表达或者表达量下调,热击蛋白家族也参与了凤丹响应铜胁迫的调控过程,尤其是小分子热击蛋白,表达量很高。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
缩略词  11-12
引言  12-13
文献综述  13-23
  1 铜污染现状及铜毒害对植物的影响  13-14
    1.1 铜污染现状  13
    1.2 铜毒害对植物的影响  13-14
  2 凤丹及观赏牡丹概述  14-16
    2.1 凤丹概况  14-15
    2.2 传统观赏牡丹概况  15-16
  3 植物耐铜机理  16-19
    3.1 植物耐铜的生理生化机理  16-17
    3.2 植物耐铜的分子生物学机理  17-19
  4 高通量测序技术及其在转录组学研究中的应用  19-23
    4.1 高通量测序技术简介  20
    4.2 应用高通量测序技术的转录组研究  20-23
第一章铜胁迫对凤丹生长及生理特性的影响  23-32
  1 材料与方法  23-24
    1.1 试验材料  23
    1.2 试验处理  23
    1.3 测定内容及方法  23-24
  2 结果与分析  24-30
    2.1 铜处理对凤丹形态指标的影响  24-25
    2.2 铜处理对凤丹生理指标的影响  25-29
    2.3 凤丹对矿质元素的吸收  29
    2.4 凤丹对铜的富集及转运  29-30
  3 讨论  30-32
第二章铜胁迫对观赏牡丹生长及抗氧化酶活性等生理特性的影响  32-41
  1 材料与方法  32-33
    1.1 材料  32
    1.2 实验方法  32-33
  2 结果与分析  33-38
    2.1 铜处理对‘肉芙蓉’牡丹生长发育的影响  33-34
    2.2 铜处理对‘肉芙蓉’牡丹生理指标的影响  34-35
    2.3 铜处理下‘肉芙蓉’牡丹对矿质元素的吸收  35-38
    2.4 ‘肉芙蓉’牡丹对铜的富集及转运  38
  3 讨论  38-41
第三章凤丹转录组测序分析  41-61
  1 材料与方法  41-43
    1.1 材料培育  41
    1.2 实验处理  41-42
    1.3 RNA提取方法  42-43
    1.4 高通量转录组测序  43
  2 结果与分析  43-58
    2.1 凤丹总RNA提取结果  43-46
    2.2 数据初步分析  46-47
    2.3 All-Unigene功能注释  47-49
    2.4 差异表达基因的分析  49-56
    2.5 相关基因分析  56-58
  3 讨论  58-61
全文结论  61-63
参考文献  63-73
攻读硕士学位期间发表的论文  73-75
附录  75-85
致谢  85

铜胁迫下凤丹和观赏牡丹的生理反应及凤丹转录组分析

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