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油菜高亲和磷转运蛋白基因BnPht1；4的功能研究

作　者: 赵彩芝
导　师: 任峰；李学宝
学　校: 华中师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: BnPht1 4 PHR1 WRKY75 磷转运蛋白油菜
分类号: S565.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一,它既是植物体内许多重要有机化合物的组分,同时又参与植物体内多种代谢过程,如碳水化合物代谢、氮素代谢、脂肪代谢等。植物对土壤中磷素的吸收主要以无机磷(Pi)的形式。土壤对磷的强烈吸附使土壤溶液中植物可吸收的可溶性无机磷的含量非常低。研究高效吸收和利用土壤磷素营养能力的分子机制,可能为了解高等植物复杂的磷素吸收和转运提供了有价值的科学资料。而且,克隆鉴定高亲和磷转运蛋白基因,并研究揭示其功能,具有重要的生物学理论意义和潜在的农业利用价值。本研究从油菜中克隆了一个高亲和磷转运蛋白基因,命名为BnPht1;4,对该基因在植物低磷应答中的功能进行了分析,主要研究结果如下：1. BnPht1;4基因的分离鉴定和特征分析从油菜cDNA文库中克隆了一个cDNA序列,其开放阅读框(open reading frame, ORF)为1605bp,编码532个氨基酸。序列分析预测该基因编码的蛋白与拟南芥中的高亲和磷转运蛋白AtPht1;4具有95%的相似性,因此将该基因命名为BnPht1;4.2. BnPhtl;4蛋白的亚细胞定位分析为了确定BnPht1;4蛋白的亚细胞定位,我们构建了融合表达载体BnPht1;4-GFP,利用基因枪转化洋葱表皮细胞,在共聚焦显微镜下观察发现该蛋白定位在质膜上。拓扑学分析发现,该蛋白具有12个跨膜区域,在第6和第7个跨膜区域间被分成两组。3. BnPhtl;4的组织表达分析为了研究BnPht1;4在正常条件和低磷条件下在油菜中的表达模式,我们提取了油菜根、下胚轴、子叶、茎、叶和花等不同组织的总RNA,进行RT-PCR分析。正常磷处理时,该基因在茎和花中的表达量较高；用低磷处理时,在根中的表达量显著上调,并且在处理12h后,其表达量急剧增加。4. BnPhtl;4启动子分离及活性分析从油菜基因组DNA中分离了BnPht1;4启动子,大小为1276bp。利用PlantCARE程序对该序列分析发现,它含有2个P1BS和2个W-box结合基序,GARE、 TGA、TCA和ABRE等激素应答元件,及MBS和LTR非生物胁迫应答元件。将BnPht1;4启动子构建到GUS融合表达载体中进行拟南芥的遗传转化,对筛选出的阳性苗进行GUS活性分析发现,当蔗糖达到一定浓度时,用低磷处理后,在根部发现较强的GUS信号,说明该基因受低磷诱导,并且依赖于蔗糖的存在。5.过量表达BnPht1;4影响拟南芥根发育将BnPht1;4构建到过量表达载体上,导入拟南芥,获得转基因植株,进行表型分析。在正常磷处理下,过量表达BnPht1;4转基因拟南芥与野生型相比,根和地上部分都没有明显差异；经低磷(50μMPi)处理后,转基因植株的鲜重高于野生型,主根的伸长显著长于野生型；尽管转基因植株的侧根的密度少于野生型,但是侧根数目多于野生型；无机磷含量的测定也得出过量表达在地上部分和根中都高于野生型。6.低磷应答下BnPht1;4受PHR1转录因子调控分析发现BnPht1;4启动子含有两个PHR1结合元件P1BS,前期研究表明PHR1能与BnPht1;4启动子相互作用,调控BnPht1;4表达。为进一步分析这两个P1BS结合元件在BnPht1;4低磷诱导中的重要性,分别对这两个元件进行缺失突变,构建了单P1BS和双P1BS突变的重组载体BnPht1;4PM1:GUS, BnPht1;4PM2:GUS和BnPht1;4PMM:GUS,转化拟南芥。对筛选出的转基因拟南芥进行低磷处理,观察GUS活性。组织化学染色分析发现,低磷处理后,单P1BS突变(BnPht1;4PM1和BnPht1;4PM2)后BnPht1;4启动子低磷诱导活性下降。在转基因拟南芥中双P1BS突变(BnPht1;4PMM)后BnPht1;4启动子低磷诱导活性并没有完全消失,这暗示在低磷应答时,除了PHR1,可能还存在其它转录因子对BnPht1;4进行调控。7. BnPht1;4可能受WRKY75转录因子调控拟南芥中WRKY家族的转录因子WRKY75也是应答低磷的一个关键调控因子,它与PHRl在调控低磷应答基因时存在功能冗余。在BnPht1;4启动子上含有两个WRKY家族转录因子的结合元件W-box基序。通过构建载体和合成探针,用酵母单杂交和EMSA实验证明了WRKY75可以与BnPht1;4启动子相结合。实验结果显示,在低磷应答中BnPht1;4受到转录因子WRKY75的调控。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-14
一、引言  14-20
  1.1 植物体内磷吸收系统的动力学特征  14
  1.2 高亲和磷转运蛋白  14-17
  1.3 磷酸盐运输促进者PHF1  17
  1.4 磷饥饿诱导的非编码RNAs  17-18
  1.5 应答低磷胁迫的转录因子  18
  1.6 立题依据及研究意义  18-20
二、实验材料  20-24
  2.1 植物材料  20
  2.2 实验所用菌种及载体  20
  2.3 实验所用的工具酶  20
  2.4 化学试剂和其它材料  20
  2.5 常用储存液  20-22
  2.6 蛋白的原核表达和纯化所用的试剂及缓冲液  22-23
  2.7 Western杂交所用试剂  23
  2.8 EMSA所用试剂  23
  2.9 仪器设备  23-24
三、实验方法  24-43
  3.1 油菜无菌苗的培养及材料收取  24
  3.2 油菜RNA的提取、纯化及逆转录  24-25
  3.3 BnPht1；4的表达分析  25-27
    3.3.1 设计引物  25-26
    3.3.2 半定量PCR  26
    3.3.3 实时荧光定量PCR  26-27
  3.4 BnPht1；4的克隆及克隆载体的构建和测序  27-31
    3.4.1 目的基因的获取  28
    3.4.2 电泳检测PCR扩增结果  28
    3.4.3 目的基因的回收  28-29
    3.4.4 克隆载体的构建  29
    3.4.5 连接产物转化感受态细胞DH5α  29
    3.4.6 阳性菌落的检测  29-30
    3.4.7 质粒的大量提取  30
    3.4.8 对目的基因进行测序  30-31
  3.5 BnPht1；4过量表达载体的构建、拟南芥转化及鉴定  31-34
    3.5.1 乙醇沉淀法回收酶切片段的步骤  31-32
    3.5.2 质粒检测  32
    3.5.3 质粒转化农杆菌  32
    3.5.4 拟南芥种子的无菌处理、种植及转化  32-33
    3.5.5 种子的收取及阳性苗的鉴定  33-34
  3.6 BnPht1；4过量表达转基因拟南芥的功能分析  34
    3.6.1 无机磷含量测定所需的试剂和实验步骤  34
    3.6.2 花青素含量的测定方法  34
  3.7 BnPht1；4启动子克隆、载体构建及拟南芥转化  34-35
  3.8 组织化学法鉴定BnPht1；4P的转基因阳性苗  35-36
  3.9 BnPht1；4P中P1BS元件突变载体构建、拟南芥的转化及鉴定  36
  3.10 BnPht1；4-GFP融合表达载体的构建及亚细胞定位分析  36-37
  3.11 WRKY75与BnPht1；4启动子相互作用的酵母单杂交实验  37-39
    3.11.1 酵母Y1HGlod感受态细胞的制备  37
    3.11.2 酵母转化  37-39
  3.12 EMSA验证WRKY75与BnPht1；4启动子相互作用  39-43
    3.12.1 感受态细胞BL21的制备  39
    3.12.2 pMAL-WRKY75的蛋白表达  39-40
    3.12.3 MBP-WRKY75融合蛋白表达纯化  40
    3.12.4 Western杂交检测纯化的蛋白  40-41
    3.12.5 MBP-WRKY75融合蛋白大量纯化  41-42
    3.12.6 DNA探针的合成  42
    3.12.7 非变性蛋白胶检测蛋白与DNA的结合  42-43
四、实验结果  43-61
  4.1 油菜BnPht1；4基因克隆  43
  4.2 BnPht1；4编码氨基酸序列分析  43-44
  4.3 系统进化树分析BnPht1；4  44-45
  4.4 油菜BnPht1；4蛋白的亚细胞定位及拓扑学结构  45-46
    4.4.1 pBI-BnPht1；4-eGFP融合表达载体的构建  45
    4.4.2 共聚焦显微镜观察BnPht1；4-eGFP融合蛋白的亚细胞定位  45
    4.4.3 BnPht1；4蛋白的拓扑学结构预测  45-46
  4.5 油菜基因BnPht1；4的表达模式分析  46-48
    4.5.1 正常磷条件下BnPht1；4在油菜中的组织表达分析  46-47
    4.5.2 低磷和恢复处理下BnPht1；4基因在油菜根中的表达情况  47-48
    4.5.3 低磷条件下BnPht1；4基因在油菜根中的表达分析  48
  4.6 低磷处理下BnPht1；4启动子活性分析  48-51
    4.6.1 BnPht1；4启动子克隆  48-49
    4.6.2 BnPht1；4启动子的序列分析  49
    4.6.3 载体pBI101-BnPht1；4P-GUS的构建和拟南芥转化  49-50
    4.6.4 转基因拟南芥GUS活性分析  50-51
  4.7 过量表达BnPht1；4影响拟南芥根的形态  51-54
    4.7.1 油菜BnPht1；4基因过量表达载体构建及拟南芥遗传转化  51
    4.7.2 过量表达BnPht1；4转基因拟南芥阳性苗的鉴定  51-52
    4.7.3 过量表达BnPht1；4转基因拟南芥的表型分析  52-54
    4.7.4 OEBnPht1；4经低磷下诱导后花青素含量的测定  54
  4.8 BnPht1；4启动子P1BS结合元件突变后活性分析  54-56
    4.8.1 载体构建和拟南芥转化  54-55
    4.8.2 BnPht1；4启动子P1BS结合元件突变后GUS活性分析  55-56
  4.9 WRKY75与BnPht1；4P相互作用的酵母单杂交和EMSA分析  56-61
    4.9.1 pAbAi-BnPht1；4P和pGADT7-WRKY75载体的构建  56
    4.9.2 pAbAi-BnPht1；4P与pGADT7-WRKY75相互作用的酵母单杂交试验  56-57
    4.9.3 原核表达载体pMAL-WRKY75的构建及感受态细胞BL21的转化  57
    4.9.4 MBP-WRKY75融合蛋白表达  57-58
    4.9.5 Western杂交检测原核表达蛋白WRKY75  58
    4.9.6 DNA探针的制备和非变性聚丙烯酰胺凝胶检测纯化的蛋白  58-59
    4.9.7 EMSA实验验证WRKY75蛋白与BnPht1；4P的相互作用  59-61
五、讨论  61-64
参考文献  64-69
附录  69-70
硕士期间发表的论文  70-71
致谢  71

油菜高亲和磷转运蛋白基因BnPht1；4的功能研究

内容摘要

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