学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

转iaaM和ABP1基因对棉花和苎麻纤维及细胞发育的影响

作　者: 黄丽华
导　师: 张学文
学　校: 湖南农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: iaaM基因 ABP1基因 棉花 苎麻 纤维和细胞发育
分类号: S562
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 10次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


植物生长素(auxin)是调控植物生长发育最重要的植物激素,关于生长素及其信号途径的研究逾百年来历久弥新。近年来有关生长素结合蛋白ABP1作用于植物细胞伸长和分裂的研究深受植物分子生物学界的关注。本研究以棉花和苎麻两种具有长纤维细胞的植物为材料,通过对生长素合成基因iaaM及生长素结合蛋白基因ABP1的转基因研究,探索了生长素及其结合蛋白ABP1对棉纤维的伸长、苎麻韧皮纤维及细胞发育的影响。棉花纤维是高度伸长的胚珠表皮细胞。生长素影响着棉纤维的发育和伸长。为了确证纤维细胞内的生长素对纤维伸长的作用,本实验将催化色氨酸转变为生长素的关键酶——色氨酸单加氧酶基因iaaM重组到棉花纤维特异表达启动子E6调控的表达载体中,构建了在纤维细胞中特异表达iaaM基因的载体并以HPTⅡ作为选择标记,采用农杆菌介导的子房注射法转化棉花“湘杂棉14”,经潮霉素抗性筛选,获得了8株抗性植株。其中5株植株基因组中检测到目的基因的整合。RT-PCR分析证明纤维细胞中iaaM基因在转录水平上能有效表达,纤维细胞中的生长素含量也相应提高。但在转基因株稳定后,连续两年的利植和分析,其棉纤维长度并未发生明显改变。生长素结合蛋白ABP1是生长素信号途径新确定的成员,但由于在模式植物拟南芥中的突变致死性使其功能的认识严重不足。为了揭示ABP1在棉花发育,尤其是棉纤维发育中的功能,本研究以“湘杂棉14”为材料,采用RT-PCR法克隆了棉花ABP1基因,该基因全长cDNA序列为792bp,与GenBank中陆地棉“新陆中5号”ABP1基因序列存在7个碱基的差别,同源性为99%,但可以编码一个保守的ABP1蛋白。采用半定量PCR方法检测了ABP1基因在棉花叶、花和开花后15d的纤维细胞中都有表达。其中在叶片中的表达量最高,在花器官和纤维细胞中的表达量稍低。为了验证ABP1在棉花纤维发育中的功能,将克隆的ABP1cDNA构建成了35S启动子控制的过表达载体并以NPTⅡ作为选择标记,经农杆菌介导转化了棉花后,筛选获得了6株Kan抗性植株,在其中3株中检测到ABP1表达水平提高。对这些ABP1过表达植株的观察分析表明,植株整体生长发育正常,纤维产量和长度变化都不显著。与受体对照植株相比,仅观察到叶缘的表皮毛密度增加。鉴于棉花纤维细胞的特殊性,我们还选取苎麻作为材料,开展ABP1与韧皮纤维及细胞发育相关的研究。利用本研究团队已克隆的苎麻ABP1cDNA (BnABP1)构建了BnABP1基因cDNA过表达载体和反义表达载体,以HPT Ⅱ作为选择标记,分别通过农杆菌介导的叶盘转化法转化苎麻“湘苎3号”,经潮霉素抗性筛选和PCR检测获得了4株ABPl过表达植株和4株ABP1反义表达植株。ABP1过表达植株整体生长发育也完全正常,未能观察到基因过表达引起的性状改变。但ABP1反义表达载体转化苎麻后,植株生长发育表现出显著抑制现象。反义转基因苗生长发育迟缓,成苗后叶片小而卷曲,叶表皮毛减少；叶脉发育不完全,叶脉小,并且在叶片的某些部位还缺乏叶脉；叶柄的发育也表现异常。对叶片进行组织切片观察到表皮细胞和栅栏细胞变小,组成主脉和侧脉的细胞小,并且主脉维管束不发达,韧皮部细胞和导管变小,还缺少一些典型细胞层,细胞间的耦合也发生了变化。叶柄切片也观察到细胞和组织的类似变化。茎的发育也表现出薄壁细胞、韧皮部细胞、导管和维管束细小,导致转基因植株茎明显小于对照；韧皮纤维细胞数量减少的同时细胞也更为短小。上述实验结果表明,棉花纤维作为特化的胚珠表皮细胞,伸长可能受多种因素共同调控,单纯提高细胞内生长素浓度或整体ABP1的表达水平对纤维伸长都没有显著作用。但ABP1表达水平的提高对棉花叶表皮毛的发育有一定的影响。对于苎麻韧皮纤维及其茎和叶细胞,它们的正常发育需要一定表达量的ABP1,过表达ABP1对其并没有剂量效应,但当ABP1表达受到抑制后其量低于一定的阈值时,细胞的分化和伸长会表现出显著异常,说明ABP1通过影响细胞的分化及伸长来影响苎麻纤维及其茎和叶的发育。对ABP1反义表达苎麻组织切片观察发现,ABP1的抑制表达并不影响其组织的初级分化。尽管植株生长受到严重抑制,但植株各组织的细胞类型分化完整,只是各类细胞都更加细小,细胞数量减少。说明ABP1表达抑制后主要影响细胞的膨大、伸长和细胞分裂频次,导致各组织中分化的细胞数量减少,器官细小。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-14
第一章 绪言  14-28
  1 生长素与植物的生长发育  14-21
    1.1 植物不同组织对生长素的敏感性不同  14
    1.2 生长素合成和运输的认识更加深入  14-15
    1.3 揭示了生长素信号通路TIR途径  15-16
    1.4 生长素结合蛋白介导了生长素引起的细胞快速伸长  16-21
  2 棉花纤维发育进程及作用机制  21-24
    2.1 棉花纤维发育过程  21-22
    2.2 棉纤维发育的机制  22-23
    2.3 棉纤维发育中生长素的作用  23-24
  3 苎麻纤维发育的研究进展  24-26
    3.1 苎麻纤维发育过程  24-25
    3.2 苎麻纤维发育的分子生物学研究  25
    3.3 植物生长调节剂对苎麻生长发育的影响  25-26
  4 生长素与其他纤维细胞的发育  26
  5 论文选题和研究意义  26-28
第二章 转iaaM基因对棉纤维发育的影响  28-42
  1 材料和方法  28-34
    1.1 实验材料  28-29
      1.1.1 植物材料及生长条件  28
      1.1.2 菌株和载体  28
      1.1.3 试剂及试剂盒  28-29
      1.1.4 基因和引物  29
    1.2 实验方法  29-34
      1.2.1 iaaM基因棉花纤维特异表达载体pWM101-E6-iaaM的构建  29-31
      1.2.2 pWM101-E6-iaaM载体转化根癌农杆菌LBA4404  31
      1.2.3 农杆菌介导法转化棉花  31
      1.2.4 转基因棉花的筛选及鉴定  31-33
      1.2.5 纤维中生长素含量的测定  33-34
      1.2.6 纤维长度的测定  34
  2 结果与分析  34-39
    2.1 棉花纤维特异表达载体pWM101-E6-iaaM的构建与鉴定  34-35
    2.2 pWM101-E6-iaaM载体转化农杆菌LBA4404  35-36
    2.3 棉花潮霉素耐受性的检测  36-37
    2.4 转iaaM基因棉花的筛选及鉴定  37
    2.5 转基因植株中iaaM基因的表达分析  37-38
    2.6 转基因植株的表型  38-39
    2.7 转基因纤维生长素含量的分析  39
    2.8 转基因纤维长度的分析  39
  3 讨论  39-42
第三章 转ABP1基因对棉纤维发育的影响  42-53
  1 材料和方法  42-45
    1.1 实验材料  42
    1.2 实验方法  42-45
      1.2.1 棉花RNA的提取  42
      1.2.2 棉花ABP1基因cDNA的克隆  42-43
      1.2.3 棉花ABP1的表达分析  43-44
      1.2.4 ABP1过表达载体的构建  44
      1.2.5 棉花的转化  44
      1.2.6 转基因棉花的筛选及鉴定  44
      1.2.7 转基因棉花ABP1基因转录表达分析  44
      1.2.8 转基因棉花的表型观察  44-45
      1.2.9 棉花表皮细胞的观察  45
      1.2.10 纤维长度的测定  45
  2 结果与分析  45-51
    2.1 棉花ABP1基因的克隆及序列分析  45-46
    2.2 ABP1的表达分析  46-48
    2.3 棉花ABP1基因过表达载体pBI121-GhABP1的构建及检测  48
    2.4 ABP1过表达植株的鉴定  48-49
      2.4.1 ABP1过表达植株的Kan抗性  48-49
      2.4.2 ABP1过表达植株的分子鉴定  49
    2.5 过表达植株ABP1基因转录表达分析  49
    2.6 过表达植株的表型  49-51
    2.7 ABP1过表达对纤维长度的影响  51
  3 讨论  51-53
第四章 转ABP1基因对苎麻韧皮纤维及细胞发育的影响  53-72
  1 材料和方法  53-57
    1.1 实验材料  53-54
      1.1.1 植物材料及生长条件  53
      1.1.2 菌株和试剂  53
      1.1.3 苎麻组织培养基  53
      1.1.4 基因和引物  53-54
    1.2 实验方法  54-57
      1.2.1 BnABP1基因过表达载体pWM101-BnABP1的构建  54
      1.2.2 BnABP1基因反义表达载体pWM101-antiBnABP1的构建  54-55
      1.2.3 农杆菌介导法转化苎麻“湘苎三号”  55
      1.2.4 转基因苎麻的鉴定  55-56
      1.2.5 转基因苎麻ABP1转录表达分析  56
      1.2.6 转基因苎麻的表型观察  56
      1.2.7 转基因苎麻叶和茎的显微观察  56-57
  2 结果与分析  57-69
    2.1 ABP1基因过表达载体pWM101-BnABP1的构建及检测  57-58
    2.2 ABP1反义表达载体pWM101-antiABP1的构建及检测  58
    2.3 ABP1过表达载体和反义表达载体转化农杆菌LBA4404  58
    2.4 苎麻潮霉素耐受性检测  58-59
    2.5 农杆菌介导法转化苎麻  59-61
      2.5.1 筛选转化细胞  59-60
      2.5.2 芽分化培养  60-61
      2.5.3 生根培养  61
      2.5.4 移栽  61
    2.6 转基因苎麻的检测  61-62
      2.6.1 ABP1过表达植株的鉴定  61-62
      2.6.2 ABP1反义表达转植株的鉴定  62
    2.7 转基因苎麻ABP1的转录表达  62-63
      2.7.1 苎麻RNA的提取  62-63
      2.7.2 过表达植株ABP1的表达水平  63
      2.7.3 反义表达植株ABP1的表达水平  63
    2.8 转基因苎麻的表型  63-69
      2.8.1 ABP1过表达植株的表型  63-65
      2.8.2 ABP1反义表达转基因植株的表型  65-69
  3 讨论  69-72
第五章 结论  72-75
参考文献  75-85
附录  85-89
致谢  89-90
作者简介  90

相似论文

  1. 两个不同叶色棉花品种光合功能对高温胁迫的响应差异及机理,Q945.11
  2. 棉花纤维初始发育的磷酸蛋白质组学研究,S562
  3. 微生物有机肥防治土传棉花黄萎病的效果及对根际微生物影响,S144.1
  4. 棉花纤维初始发育期14-3-3相互作用蛋白的酵母双杂交筛选,S562
  5. 转录因子在棉纤维起始期的表达特征及三个转录因子基因的克隆与功能初步分析,Q943
  6. 棉铃虫Cry1Ac抗性相关钙粘蛋白基因缺失突变的适合度代价,S435.622.3
  7. 防治土传棉花黄萎病微生物有机肥研制与生物效应研究,S435.621
  8. 蕾花期涝渍胁迫后棉花（Gossypium hirsutum L.）恢复生长的生理机制研究,S562
  9. 花铃期遮荫对棉花（Gossypium hirsutum L.）生长发育及氮素代谢特征的影响,S562
  10. 土壤盐分胁迫对棉田土壤微生态的影响,S562
  11. 棉花间歇性土壤涝渍的产质效应及其生理基础研究,S562
  12. 陆地棉矮化突变体Ari1327的形态、生理和分子标记研究,S562
  13. 棉纤维起始发育优势基因表达谱和三个新基因的克隆与功能初步分析,S562
  14. 利用棉纤维发育相关基因研究不同棉种分子进化,S562
  15. 施氮量对棉花（Gossypium hirsutum L.）氮素利用及氨挥发损失的影响,S562
  16. 棉铃对位叶氮浓度影响纤维比强度形成的生理机制研究,S562
  17. 不同开花期棉铃氮素累积与分配特性对棉铃品质形成的影响,S562
  18. 种植密度对棉铃（纤维、棉籽）品质形成的影响,S562
  19. 柱头外露性状应用于棉花杂交制种及其诱导效应研究,S562
  20. 陆地棉Aux/IAA家族九个基因的克隆和表达分析,S562
  21. 陆地棉细胞质雄性不育及其恢复机制的研究,S562

中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 纤维作物 > 棉
© 2012 www.xueweilunwen.com