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OsTFL2基因在水稻开花调控网络中的定位研究及OsMED32基因干扰载体的构建

作　者: 张晓东
导　师: 关和新
学　校: 广西大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: OsTFL2RNAi背景 RNA原位杂交 开花调控网络 调停蛋白复合体 OsMED32
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


植物开花受到遗传途径、环境因素以及植物育种状态的综合调控,其中开花诱导是开花植物生殖生长启动的第一步,也是基因间相互作用最复杂的一个过程。水稻开花涉及很多基因,且这些基因间又相互作用,从而形成调控水稻开花的网络。本研究利用原位杂交实验技术揭示了在OsTFL2RNAi背景下水稻中开花调控基因的表达模式和表达量的变化,来寻找OsTFL2的物理学/遗传学下游基因。通过对水稻不同品种DNA和CDS的序列分析得知,不同水稻品种OsTEL2DNA的序列同样具有保守性,但OsTFL2序列的高保守性并不等同于性状的高保守性；在水稻中同样存在序列的“插入和缺失”,加之不同水稻品种DNA和CDS之间的分歧,推测在细胞减数分裂时发生的不等交换以及RNA加工去除内含子这两个过程是OsTFL2基因变异的主要来源,而OsTFL2RNA加工和功能表现型则可能同时也受到遗传背景的调控,在不同水稻品种中有不同的开花机理,OsTFL2促进开花这一功能因品种的不同而存在差别,探索OsTFL2基因在水稻开花诱导和花发育过程中的如何发挥作用。Mediator complex subunit32(MED32)和哺乳类中的MED29以及酵母中的MED2属于同源基因,OsMED32蛋白是Mediator complex尾端的一部分且是DNA结合转录因子。本试验中所研究的OsMED32利用RNAi技术,构建OsMED32过表达和干扰表达载体并转化至农杆菌中,使OsMED32在水稻中过量表达及表达沉默,从而探索OsMED32的基因功能,可以进一步探索OsMED32蛋白对OsTFL2转录表达的调控作用。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-7
縮略词表  7-11
1 前言  11-20
  1.1 拟南芥开花调控机理  11
  1.2 水稻开花调控网络机理  11-13
  1.3 植物TFL2基因的功能  13-15
    1.3.1 拟南芥AtTFL2基因的功能  13-14
    1.3.2 水稻OsTFL2基因的功能  14-15
  1.4 MED蛋白的研究进展  15-18
  1.5 RNAi技术在本研究中的应用  18-19
  1.6 本研究的目的与意义  19-20
2 材料与方法  20-36
  2.1 水稻TFL2RNAi背景下开花基因的RNA原位杂交  20-25
    2.1.1 实验材料  20
    2.1.2 质粒与分子生物学试剂  20
    2.1.3 材料固定  20
    2.1.4 脱水  20-21
    2.1.5 透明  21
    2.1.6 透蜡  21
    2.1.7 包埋  21
    2.1.8 切片  21
    2.1.9 原位杂交RNA探针的制备  21-24
    2.1.10 切片的预处理  24
    2.1.11 预杂交与杂交  24
    2.1.12 洗涤  24
    2.1.13 检测杂交信号  24-25
  2.2 水稻Hd3a在TFL2RNAi背景下的半定量RT-PCR  25-27
    2.2.1 实验材料  25
    2.2.2 主要分子生物学试剂  25
    2.2.3 提取水稻总RNA  25
    2.2.4 反转录合成cDNA  25-26
    2.2.5 水稻Hd3a在TFL2RNAi背景下的半定量RT-PCR  26-27
  2.3 OsTFL2 DNA和cDNA的序列分析  27
    2.3.1 水稻OsTFL2 DNA和cDNA序列的来源  27
    2.3.2 序列分析方法  27
  2.4 OsMED32表达载体的构建  27-36
    2.4.1 材料  27
    2.4.2 质粒载体与分子生物学试剂  27-28
    2.4.3 引物  28
    2.4.4 水稻基因组DNA的提取  28-29
    2.4.5 制备大肠杆菌DH5α感受态细胞  29
    2.4.6 OsMED32 Overexpress(OsMED32 OE)表达载体的构建  29-33
    2.4.7 OsMED32干扰载体构建  33-34
    2.4.8 植物表达载体向农杆菌中转化  34-36
3 结果与分析  36-53
  3.1 水稻TFL2RNAi背景下开花基因的RNA原位杂交结果与分析  36-40
  3.2 TFL2RNAi背景下Hd3a的半定量RT-PCR结果分析  40-42
    3.2.1 水稻总RNA和cDNA  40-41
    3.2.2 水稻Hd3a半定量RT-PCR分析  41-42
  3.3 OsTFL2 DNA和cDNA序列的序列分析  42-43
  3.4 OsMED32表达载体的构建  43-53
    3.4.1 OsMED32OE表达载体的构建  43-47
    3.4.2 OsMED32 RNAi表达载体的构建  47-51
    3.4.3 农杆菌中过表达载体的菌液PCR鉴定  51-52
    3.4.4 农杆菌中干扰表达载体的菌液PCR鉴定  52-53
4 讨论  53-58
  4.1 RNA原位杂交技术的重要性  53
  4.2 OsTFL2与水稻开花基因之间的调控关系  53-54
  4.3 应用RNA干扰技术研究水稻开花基因功能  54-55
  4.4 RNA沉默效率  55
  4.5 OsTFL2 DNA和cDNA序列的保守性与趋异性  55-56
    4.5.1 OsTFL2 DNA和cDNA序列的保守性  55-56
    4.5.2 OsTFL2 DNA和cDNA序列的趋异性  56
  4.6 MED蛋白在植物中的调控作用  56-58
5 结论  58-59
致谢  59-60
参考文献  60-66
附录A  66-68
附录B  68-71
附录C  71

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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