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苯脲类除草剂酶联免疫检测方法的研究

作　者: 袁萌
导　师: 王硕
学　校: 天津科技大学
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 苯脲类除草剂 酶联免疫检测 间接竞争 定量构效关系 分子模拟
分类号: S482.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


本论文制备了识别苯脲类除草剂的单克隆抗体,建立了一种检测苯脲类除草剂的酶联免疫吸附检测方法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)。通过计算机辅助分子模拟(Computer-Aided Molecular Modeling, CAMM)及定量结构-效应关系(Quantitative Structure-Activity Relationship, QSAR)的方法,系统研究了抗原对抗体识别的影响。将半抗原与牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)偶联,获得免疫原免疫小鼠。将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。通过有限稀释克隆法克隆并筛选得到最优的单克隆抗体。优化包被量、抗体量、酶标二抗量、封闭液等条件,建立了间接竞争ELISA方法,可同时检测12种苯脲类除草剂。针对不同待测物,该方法的灵敏度为1.7-920.7ng/mL,检出限为0.4-76.9ng/mL。对海河水进行预处理,并使用该ELISA方法检测其中添加的苯脲类除草剂,回收率在77.05-121.71%之间,说明该方法准确可靠。使用CAMM结合QSAR方法分析了苯脲类除草剂分子结构、亚结构及其性质对抗体识别的影响,发现：(1)该小分子抗原的疏水性对抗体识别有极为重要的影响,且其贡献与抗体识别效率呈二次相关：(2)抗原分子的最低未占据分子轨道能量ELUMO对抗体识别有重要影响；(3)通常认为,用于连接载体蛋白的基团较少暴露在免疫反应环境中,故对抗体识别贡献不大,所以在免疫分析中抗原上同样位置的基团对抗原抗体反应也无影响,但本研究证实苯脲类除草剂分子的该基团对抗体识别有重大的影响。本文首次将Hansch方程、亚结构水平的二维QSAR和分子全息QSAR引入到抗原抗体反应的研究中。本研究证实,CAMM结合QSAR的研究方法是进一步探究抗体识别机理的有力工具。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-6
目录  6-8
1 前言  8-22
  1.1 农药污染现状及危害  8-9
  1.2 农药残留的主要检测方法  9-15
    1.2.1 色谱分析方法  9-12
    1.2.2 免疫分析方法  12-15
  1.3 单克隆抗体技术简介  15-16
  1.4 苯脲类除草剂概述  16-19
    1.4.1 苯脲类除草剂  16-17
    1.4.2 苯脲类除草剂的危害  17
    1.4.3 苯脲类除草剂残留检测研究进展  17-19
  1.5 分子模拟在免疫分析中的应用  19-20
    1.5.1 分子模拟在半抗原设计中的应用  19
    1.5.2 分子模拟在免疫识别机制研究中的应用  19-20
  1.6 论文的研究意义及目的  20-21
  1.7 论文的研究内容  21-22
2 材料与方法  22-33
  2.1 实验材料  22-24
    2.1.1 主要药品和试剂  22-23
    2.1.2 主要仪器与设备  23
    2.1.3 常用缓冲液和细胞培养试剂的配制  23-24
    2.1.4 待测样品  24
    2.1.5 主要软件  24
  2.2 实验方法  24-30
    2.2.1 半抗原的设计  24-25
    2.2.2 载体蛋白的连接  25
    2.2.3 抗体的评价方法  25
    2.2.4 苯脲类除草剂单克隆抗体的制备  25-28
    2.2.5 间接竞争ELISA的建立  28-29
    2.2.6 苯脲类除草剂间接竞争ELISA的特异性  29
    2.2.7 样品中回收率的测定  29-30
  2.3 分子模拟分析  30-33
    2.3.1 分子最低能量构象  30
    2.3.2 骨架叠合  30-31
    2.3.3 小分子物理化学性质参数的计算  31
    2.3.4 Pearson相关性分析  31
    2.3.5 2D-QSAR分析  31
    2.3.6 分子全息QSAR分析  31-33
3 结果与讨论  33-55
  3.1 苯脲类除草剂抗体的制备和鉴定  33-36
    3.1.1 小鼠抗血清效价与特异性的测定  33-34
    3.1.2 杂交瘤细胞株的筛选、克隆和建立  34-35
    3.1.3 单克隆抗体的亚类鉴定和纯化  35-36
  3.2 基于单克隆抗体间接竞争ELISA方法的建立  36-43
    3.2.1 包被原的选择  36-37
    3.2.2 包被抗原量和抗体浓度的优化  37-38
    3.2.3 酶标二抗量的优化  38-39
    3.2.4 封闭液的优化  39-40
    3.2.5 间接竞争ELISA的灵敏度和检出限  40-43
  3.3 样品中回收率的测定  43-44
    3.3.1 基质影响的消除  43-44
    3.3.2 添加回收试验  44
  3.4 分子模拟分析  44-55
    3.4.1 分子最低能量构象的优化  45-46
    3.4.2 骨架叠合  46-47
    3.4.3 苯脲类除草剂抗体识别2D-QSAR模型的建立和分析  47-51
    3.4.4 苯脲类除草剂抗体识别分子全息QSAR模型的建立和分析  51-55
4 结论  55-56
5 展望  56-57
6 参考文献  57-66
7 攻读硕士学位期间发表论文情况  66-67
8 致谢  67

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 农药防治（化学防治） > 各种农药 > 除草剂（杀草剂）
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