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1.tmTNF-α改善脂肪细胞胰岛素抵抗及其分子机制 2.TNF-α保守序列突变体的构建及改构TNFRBP三聚体化研究

作 者: 刘莉
导 师: 李卓娅;杨祥良
学 校: 华中科技大学
专 业: 分子免疫学
关键词: tmTNF-α 胰岛素抵抗 IL-6 MCP-1 脂联素 PPAR-γ NF-κB 三聚体 TNF-α TNFRBP 分子模拟 保守氨基酸
分类号: R587.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


肥胖与胰岛素抵抗密切相关,是非胰岛素依赖型糖尿病发病的高危因素之一。胰岛素抵抗是指机体对胰岛素的敏感性下降,即对一定量的胰岛素生物学反应低于正常水平,表现为胰岛素所作用的外周组织尤其是肌肉和脂肪组织对葡萄糖的摄取减少,肝脏糖异生作用增强,常伴随2型糖尿病、脂代谢异常、高血压及心血管疾病。ΤΝF-α是一种具有多样性生物学功能的细胞因子,它首先以26kD的跨膜形式在细胞表面表达,称为跨膜型ΤΝF-α(tmΤΝF-α),经过ΤΝF-α转化酶(TACE)的水解,释放胞外段而成为17kD的分泌型ΤΝF-α(sΤΝF-α)。现已证实sTNF-α是肥胖和胰岛素抵抗的重要连接分子之一,发挥了重要的致病作用。而我们的前期实验和他人的研究证据表明tmTNF-α在胰岛素抵抗中发挥着与sTNF-α不同的作用。本研究旨在探讨tmTNF-α在脂肪细胞胰岛素抵抗中的作用,进一步探讨其作用的分子机制和信号通路,为干预肥胖及其并发症提供新的线索。其主要研究结果如下:一、tmTNF-α直接促进胰岛素信号转导,提高脂肪细胞对胰岛素的敏感性将外源性tmTNF-α和sTNF-α分别作用于成熟脂肪细胞,结果显示sTNF-α抑制IRS-1酪氨酸及下游分子AKT的磷酸化,可直接干扰脂肪细胞的胰岛素信号转导,故抑制胰岛素诱导的葡萄糖摄取;而tmTNF-α则促进了IRS-1酪氨酸磷酸化及AKT的磷酸化,使脂肪细胞对胰岛素敏感性增加,对葡萄糖摄取率比对照组增加了近一倍。二、tmTNF-α通过下调胰岛素抵抗因子的表达,提高脂肪细胞对胰岛素的敏感性1.用Real time PCR和ELISA证实tmTNF-α与sTNF-α作用相反,明显抑制促胰岛素抵抗分子IL-6MCP-1的基因和蛋白表达;2.sTNF-α可促进脂肪细胞的脂解作用,使细胞上清游离脂肪酸含量明显增加,而tmTNF-α则与对照组无差异,其不促进脂肪细胞脂解。3.tmTNF-α通过抑制IκB-α的降解而阻断NF-κB的活化,进而下调促胰岛素抵抗分子的表达。三、tmTNF-α通过上调胰岛素敏感因子的表达,提高脂肪细胞对胰岛素的敏感性1.tmTNF-α明显促进胰岛素敏感分子脂联素mRNA表达,而sTNF-α则抑制其表达。2.tmTNF-α明显促进PPAR-γ的表达;用PPAR-γ抑制剂GW9662可减少tmTNF-α诱导的PPAR-γ表达,明显拮抗tmTNF-α的促脂联素mRNA表达的作用,而GW9662单独处理脂肪细胞并无明显作用。3.此外,GW9662还可部分阻断tmTNF-α促进胰岛素信号通路分子AKT的磷酸化及葡萄糖的摄取,而GW9662单独并无明显作用。结论: tmTNF-α在脂肪细胞胰岛素抵抗中与sTNF-α发挥不同的作用。(1)tmTNF-α可通过直接促进胰岛素信号转导,而增加脂肪细胞对胰岛素的敏感性;(2)tmTNF-α可通过抑制NF-κB活化而下调促胰岛素抵抗因子MCP-1和IL-6的表达;(3)tmTNF-α可通过促进PPAR-γ表达而上调胰岛素敏感因子脂联素的表达,从而增加脂肪细胞对胰岛素的敏感性。该研究不但为两型TNF-α对胰岛素抵抗的不同作用机制提供实验依据,且为干预肥胖及其并发症提供了新的线索。第二部分TNF-α保守序列突变体的构建及改构的TNFRBP三聚体化相关研究肿瘤坏死因子超家族成员广泛参与机体的许多生理、病理过程,介导炎症反应、凋亡、免疫应答等各种不同生物学功能。这些膜蛋白的共同特征是具有生物活性形式的三聚体,及在分子一级结构上的高度保守氨基酸残基序列。因此,我们推测TNF超家族成员的高度保守序列可能是形成其共同特征即三聚体化的分子基础。由于119-130正好位于TNF-α的保守序列并且在单体的接触面上,故本课题采用重叠PCR技术,构建pcDNA3.0-TNF-α△119-122突变体重组体,为TNF-α分子结构和功能关系的深入研究提供线索。而TNF-α生物学效应的发挥,有赖于其与靶细胞上的TNFR的结合。本课题组在前期的研究中以从噬菌体随机肽库中筛选出由12个氨基酸组成的TNFR封闭肽(TNFRBP),可与TNF受体特异性结合,竞争性抑制TNF-α的活性。本研究根据分子模建,模仿TNF-α的空间构象和作用特性,筛选出TNF-α三聚体形成的关键氨基酸及这些氨基酸与TNFRBP结合后能模拟TNF-α体外形成三聚体的最佳模拟构象,在原TNFRBP(12肽)上首尾分别连接选自TNF-α的保守序列Ile58 Tyr59 Ser60和Gly122 Val123 Phe124,对其进行改构,以期可以提高其与野生型配体的竞争力并克服易降解的缺陷,而提高其生物学效应。从而对TNF-α的基础研究与临床应用具有重要的理论意义及实用价值。主要结果如下:一、pcDNA3.0-TNF-α△119-122突变体重组质粒的构建,克隆及鉴定1.重组体的构建及克隆:以pcDNA3.0-wtTNF-α质粒作为模板,用重叠PCR法缺失突变第119-122位氨基酸,用BamHI和XhoI对pcDNA3.0载体和目的基因进行双酶切,用T4 DNA连接酶连接后,将连接产物转化DH5α,通过其氨苄抗性挑选出阳性克隆。2.阳性克隆的鉴定:通过菌落PCR及上述内切酶双酶切初步鉴定后,筛选出阳性克隆,进一步送DNA测序分析,证实在预计位点发生缺失性突变,其余核苷酸序列与野生型TNF-α的序列相同,证实缺失性突变获得成功。二、化学交联检测TNFRBP改构肽(18肽)三聚体的形成以sTNF-α蛋白为阳性对照,化学交联检测TNFRBP改构肽三聚体的形成。结果显示sTNF-α蛋白经过化学交联后,可以单体、二聚体、三聚体三种形式同时存在,而TNFRBP交联后只以单体形式存在,并无二聚体、三聚体的形成。提示我们改构后的TNFRBP(18肽)并不会在体外形成三聚体。三、TNFRBP原肽(12肽)及改构肽(18肽)对sTNF-α胞毒效应的拮抗作用通过MTT检测证实TNFRBP原肽对sTNF-α胞毒效应具有明显的拮抗作用,并且其拮抗率在一定范围内是随着浓度的增加而增加的;而TNFRBP改构肽对sTNF-α胞毒效应则无明显的抑制作用。结论:1. pcDNA3.0-TNF-α△119-122突变体重组质粒构建成功,为进一步检测其生物学功能以验证该位点是否和TNF-α三聚体形成有关奠定基础。2.改构后的TNFRBP(18肽)并不会在体外形成三聚体,且丧失其原肽的TNF阻断效应。本研究为TNF-α分子结构和功能关系的深入研究提供线索。

全文目录


英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-11
ABSTRACT  11-16
第一部分 TNF-α 的学位论文">tmTNF-α改善脂肪细胞胰岛素抵抗及其分子机制  16-48
  前言  16-18
  材料与方法  18-35
  结果  35-45
  讨论  45-48
第二部分 TNF-α保守序列突变体的构建及改构后的TNFRBP 三聚体化相关研究  48-72
  前言  48-50
  材料与方法  50-62
  结果  62-69
  讨论  69-72
小结  72-73
本论文主要创新点  73-74
参考文献  74-80
综述  80-98
  参考文献  88-98
致谢  98

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病
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