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几株绿僵菌清除自由基活性物质及代谢组学的研究

作　者: 庄梦敏
导　师: 胡丰林
学　校: 安徽农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 成分分析清除自由基提取条件代谢组学生物测定菌丝生长
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

绿僵菌属真菌是一类广泛应用的昆虫病原真菌，也是最早用于生物防治的虫生真菌类型之一。由于清除自由基活性物质有一定的应用潜力，同时自由基清除活性与菌株的抗逆性高有关，因此本研究对实验室13株不同来源绿僵菌的清除自由基活性进行了比较研究，并对高活性菌株中具清除自由基活性的物质进行了提取条件研究。同时，本研究重点是首次采用代谢组学的方法研究了绿僵菌的毒力标记物，为高毒力菌株筛选和鉴定提供新的科学依据。本研究还对高毒力菌株的培养条件也进行了研究。具体研究内容及结果如下：一．不同绿僵菌的清除自由基活性比较发现，金龟子绿僵菌和黄绿绿僵菌的清除自由基活性较强，其中金龟子绿僵菌菌株Ma12的甲醇提取物和乙酸乙酯提取物都有较强的清除自由基活性，表明该菌中同时存在极性较高和极性较低的自由基清除剂，因此本研究对其做进一步的活性成分提取条件优化研究。在研究提取溶剂、物料比、超声功率、超声时间、浸提时间和浸提温度、甲醇浓度等单因素对金龟子绿僵菌菌丝中具清除自由基活性成分的提取率影响基础上，利用极差分析找出了三个主要影响因子：超声时间、浸提时间、甲醇浓度。经过分析确定了这三个主要影响因素的最佳组合：超声时间51min，浸提时间234min，甲醇浓度90%。在优化提取条件下，金龟子绿僵菌菌丝提取物的自由基清除率达到92.17%。二．通过生物测定，结合DPS软件分析可知，在供试的几株绿僵菌菌株中，不同的菌株对大蜡螟的致病力顺序为：Mf01、Mc02、Ma09、Mvi02、Mt09。其中Mf01、 Mc02对大蜡螟的致病力显著高于其它3个菌株。从所有供试菌株的液质联用分析结果及代谢组学分析结果可以看出供试菌株代谢物有明显差异。从载荷图中可看到多个分散点，它们是几组样品中与分组最相关的代谢物，其中有16种差异标记物被识别。 PLS-DA模型中，用于衡量该分类模型的拟合良好性的参数R2Y为0.973，用于衡量该分类模型预测能力的参数Q2为0.924，这些说明该模型是可信的。因此高毒力菌株Mf02、Mc02中含有一些有别于其他菌株的差异标记物可作为高毒力绿僵菌菌株的判断指标。三．通过对不同培养基、不同氮营养和碳营养对黄绿绿僵菌菌丝生长及产孢量的影响的研究发现，在供试的PDA培养基、PSA培养基、SDAY培养基和Czapek培养基4种培养基中，PDA培养基上的菌落直径最大，菌丝生长的最好，其次是是SDAY培养基，菌丝生长最差的是Czapek培养基。且在PDA培养基上分生孢子最多，其次是SDAY培养基，Czapek培养基上最小。在不同的氮营养培养基上，黄绿绿僵菌在以蛋白胨为氮源的培养基中菌丝生长速率最大，其次是酵母粉，在以硫酸铵为氮营养的培养基中生长速率的最慢。而在6种氮营养培养基上分生孢子产生量也存在着较大的差异，在硝酸钾和蛋白胨为氮源的培养基上分生孢子产生量较好，其次是酵母和硝酸钠，在以硫酸铵为氮源的培养基上分生孢子产生量最小。在供试的7种碳营养中，黄绿绿僵菌在麦芽糖中的菌丝生长最好，其次是蔗糖和葡萄糖，较差的是甘露醇，而甘油最差。不同碳源对分生孢子的产生也有较大影响，其中在麦芽糖和甘露醇上的孢子产量最大，其次是淀粉，最差的是甘油。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-8
1 文献综述  8-16
2 引言  16-17
3 材料与方法  17-24
  3.1 材料  17-19
    3.1.1 供试菌株及蝗虫  17
    3.1.2 培养基  17-18
    3.1.3 主要仪器和试剂  18-19
  3.2 方法  19-24
    3.2.1 培养方法  19-20
    3.2.2 样品的处理  20
    3.2.3 所有供试菌株代谢物的分析比较  20-21
      3.2.3.1 样品准备  20
      3.2.3.2 自由基清除活性的定量比较  20
      3.2.3.3 液质联用分析法  20-21
    3.2.4 金龟子绿僵菌清除自由基活性物质提取条件的优化  21-22
    3.2.5 绿僵菌的毒力测定  22
    3.2.6 不同营养成分对绿僵菌菌丝生长及产孢量的影响  22-24
4 结果与分析  24-40
  4.1 所有供试绿僵菌菌株菌丝体甲醇和乙酸乙酯提取物的清除自由基活性的比较  24-25
  4.2 金龟子绿僵菌清除自由基活性物质提取条件的优化  25-31
    4.2.1 提取条件的单因素实验  25-28
    4.2.2 RCEF0578 活性物质提取工艺响应面实验结果  28-31
  4.3 菌株的毒力标记物研究  31-36
    4.3.1 菌株的毒力测定  31-32
    4.3.2 基于液质联用的绿僵菌代谢组学分析  32-36
  4.4 不同营养成分对绿僵菌菌丝生长及产孢量的影响  36-40
    4.4.1 不同培养基对黄绿绿僵菌菌丝生长及分生孢子产生量的影响  36-37
    4.4.2 不同 N 营养对黄绿绿僵菌菌丝生长及分生孢子产生量的影响  37-38
    4.4.3 不同 C 营养对黄绿绿僵菌菌丝生长及分生孢子产生量的影响  38-40
5 讨论  40-42
  5.1 几种绿僵菌的代谢组学分析  40
  5.2 清除自由基活性成分提取条件的优化  40-41
  5.3 绿僵菌的毒力测定  41
  5.4 不同营养成分对对绿僵菌菌丝及产孢量的影响  41-42
6 结论  42-44
  6.1 清除自由基活性成分提取条件的优化  42
  6.2 绿僵菌的毒力测定  42
  6.3 几种绿僵菌的代谢组学分析  42
  6.4 不同营养成分对对绿僵菌菌丝及产孢量的影响  42-44
参考文献  44-50
致谢  50-51
作者简介  51
攻读硕士期间发表的学术论文目录  51

几株绿僵菌清除自由基活性物质及代谢组学的研究

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