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活血与清热药物组分配伍对高糖培养内皮细胞分泌功能的影响

作　者: 王朋倩
导　师: 刘喜明
学　校: 中国中医科学院
专　业: 中医内科学
关键词: 高糖内皮细胞分泌功能血管舒缩纤溶系统
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的活血与清热类中药是治疗糖尿病血管并发症的两类常用的药物,活血化瘀类药物以丹参、三七为代表,清热类中药以黄连为代表。本研究选取这三种代表性药物的主要组分：丹参酚酸B(D)、三七总皂甙(S)、黄连总生物碱(H),通过观察三者配伍对高糖培养的内皮细胞分泌的血管活性物质及核因子-κB表达的影响,探讨三种中药组分配伍对内皮细胞的分泌功能、血管舒缩及相关纤溶系统的作用,阐释中医药保护血管内皮功能的作用机理,以期为中药防治糖尿病血管并发症提供基础研究支撑。方法(1)建立高糖损伤的内皮细胞模型：采用原代人脐静脉内皮细胞,分别采用葡萄糖浓度为5.5、15、30mmol／L的培养基培养内皮细胞6、12、24、36、48h,采用MTT法检测内皮细胞增殖活力,选择对内皮细胞增殖抑制作用较强的时间点和糖浓度,作为最佳的高糖损伤成模条件。(2)筛选三种配伍药物组分的干预应用浓度：分别采用不同浓度的三种中药有效组分,干预内皮细胞,其中丹参酚酸B(D)浓度采用0、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.4、0.5、1mg／ml,三七总皂苷(S)浓度采用0.05、0.1、0.2、0.4mg／ml,黄连总生物碱(H)浓度采用0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20mg／l,分别培养48h后,MTT检测细胞活力,筛选三种药物组分浓度的大、中、小三个有效剂量。(3)三种药物组分配伍对内皮细胞增殖活力的影响：分别采用三种药物组分的有效剂量作为最终浓度,进行组分配伍,分为D、S、H、DS、DH、SH、DSH七个药物组,对高糖模型的内皮细胞进行干预,培养48h后,MTT检测细胞增殖活力。(4)三种药物组分配伍对内皮细胞分泌功能及其调控：D、S、H、DS、DH、SH、DSH七个药物组,对高糖模型的内皮细胞进行干预,培养48h后,亚硝酸还原酶法检测培养上清中NO,比色法检测上清中NOS活力及其分型,ELISA检测上清中t-PA、PAI-1、PGI2,放射免疫法检测上清中ET-1、ANG-Ⅱ、TXB2, RT-PCR检测ET-1mRNA和;NOSmRNA的表达,Western blot检测核因子-KB(NF-κB) P65蛋白的表达。结果(1)高糖损伤内皮细胞模型：内皮细胞经5.5、15、30mmol／L糖浓度培养48h后,细胞增殖活力差别最大,高糖1组(HG1,15mmol／L)较正常组(ZC,5.5mmol／L)显著下降(P=0.006),下降约5.522%,高糖2组(HG2,30mmol／L)较正常组显著下降(P=0.000),下降约12.835%,并且HG2组细胞活力显著低于HG1组(P=0.001)。因此,采用30mmol／L高糖培养48h作为最佳成模条件。(2)三种药物组分浓度：丹参酚酸B(D)浓度为0.02mg／ml-0.1mg／ml促进细胞增殖,浓度达到0.1mg／ml以上时,细胞活力降低。三七总皂甙(S)浓度为50-400mg／ml,细胞增殖活性均增高,以100mg／ml最为明显。黄连总生物碱(H)对内皮细胞增殖具有抑制作用,并随浓度的增加,抑制作用增强。因此,D选择中等剂量0.04mg／ml,S选用促增殖最为明显的0.1mg／ml,H选用抑制细胞增殖最弱的0.02mg／L。(3)三种药物组分配伍对内皮细胞增殖活力的影响：三种药物组分及其配伍组(D、S、H、DS、DH、SH、DSH)均有促进细胞增殖的作用,其中以DSH增殖效应最明显,促增殖作用从强到弱依次为：DSH>D>S>DS>H>DH>SH,DSH组较HG组增殖活力提高了36.997%。(4)三种药物组分配伍对内皮细胞分泌功能及其调控的作用：药物组分配伍能有效提高高糖培养的内皮细胞NO的分泌(P<0.05),提高培养上清中TNOS的活力,降低iNOS活力,抑制ET-1的分泌,其中以DSH组作用最为显著。药物组份配伍对ANG-Ⅱ的抑制作用以SH最为显著。DS组与S能有效抑制内皮细胞分泌PAI-1(P<0.05),以DS抑制作用最为明显,而D、H则无明显作用。以DS组对PAI-1的抑制作用最明显。D、H、SH组具有促进内皮细胞分泌t-PA的作用(P<0.05),以SH促分泌作用显著,S对t-PA的调节作用不显著。D、S、DSH组对内皮细胞具有显著促进PGI2分泌的作用(P<0.05),以DSH组促分泌作用最明显,其次为D。药物组分配伍能有效降低TXB2的浓度,其中以含有的D的药物作用最强。D对ET-1mRNA具有明显的抑制作用(P=0.000),S和H对ET-1的调节作用不明显,但S和H之前存在交互作用(P=0.010),能起到协同增效的作用,从而显著抑制ET-1mRNA的表达。D、S、H三种组分之间也存在交互作用(P=0.025),当三种药物同时组合应用时抑制ET-1mRNA表达的作用最为显著。药物促进高糖培养的内皮细胞NOS3的表达(P=0.007),各组NOS3mRNA表达的从高到低依次是ZC>S>DSH>H>SH>D>HG>DS>DH。结论高糖损伤内皮细胞,可能通过诱导NF-κB核转位,导致内皮细胞功能紊乱,血管舒缩因子分泌失调,凝血功能亢进；活血与清热药物组分配伍能有效抑制NF-κB的激活,调节内皮细胞分泌功能,改善血管抗血栓能力；NF-κB通路可能是活血与清热药物保护血管、预防并发症的一个重要作用位点。

全文目录

中文摘要  6-10
ABSTRACT  10-14
综述一内皮细胞功能概述  14-17
  1.屏障功能  14
  2.分泌功能  14-16
  3.促进血管形成  16-17
综述二高糖对内皮细胞的损伤  17-21
  1.高糖对氧化作用的影响  17-18
  2.高糖对血管内皮细胞分泌活性物质的影响  18-20
  3.高糖对细胞凋亡的影响  20-21
综述三中药在糖尿病血管并发症中的研究  21-33
  1.丹参  21-22
  2.三七  22-24
  3.黄连  24-26
  4.问题及展望  26-33
前言  33-34
第一部分 HUVEC复苏培养、传代与冻存  34-37
  1 材料与仪器  34
  2 方法  34-35
  3 结果  35-36
  参考文献  36-37
第二部分三种药物组分配伍对高糖培养的内皮细胞增殖的影响  37-45
  1 主要材料与仪器  37
  2 方法  37-38
  3 结果  38-42
  4 讨论  42-44
  参考文献  44-45
第三部分三种药物组分配伍对高糖培养内皮细胞分泌功能影响  45-59
  1 主要材料与仪器  45
  2 方法  45-49
  3 结果  49-56
  4.讨论  56-58
  参考文献  58-59
第四部分三种药物组份对NOS、ET-1MRNA表达的影响  59-68
  1 主要材料与仪器  59
  2 方法  59-61
  3 结果  61-64
  4.讨论  64-66
  参考文献  66-68
第五部分三种药物组份对NF-κB P65蛋白表达的影响  68-75
  1 主要材料与仪器  68-70
  方法  70-73
  3 结果  73
  4 讨论  73-74
  参考文献  74-75
第六部分研究结论  75-76
致谢  76-77
个人简介  77-78

活血与清热药物组分配伍对高糖培养内皮细胞分泌功能的影响

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