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冰酒发酵过程中酵母菌的多样性及动态变化研究

作　者: 黄英子
导　师: 刘延琳
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 发酵工程
关键词: 冰酒 酵母菌 WLN培养基（Wallersteins Laboratory Nurtrient agar） 26S rDNA D1/D2区序列分析 Interdelta指纹图谱
分类号: TS262.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


冰酒，即冰葡萄酒，以其独特、浓郁、甜香醇厚的风味，漫长的酿造过程而身价倍增，被誉为“液体黄金”。但是冰酒原料的高糖、高酸环境及其发酵过程要求的低温等特殊条件对酵母提出了严格的要求。本研究利用WLN培养基（Wallersteins Laboratory Nurtrient agar）、26S rDNA D1/D2区序列和Interdelta指纹图谱分析等方法，对我国冰酒地理标志产区——甘肃祁连酒庄冰酒主栽品种（美乐、贵人香）冰酒自然发酵和接种发酵过程中采集到的1214株酵母菌株进行归类鉴定，并对其中的酿酒酵母菌株进行基因型分型，以收集葡萄酒相关酵母资源，了解我国甘肃冰酒酿造过程中酵母菌菌群的多样性和动态变化，为冰酒发酵的微生物控制和冰酒风味改良及品质提升提供依据，从冰酒中筛选到的野生酿酒酵母也为以后筛选优良酵母菌株提供了菌种资源，进而为筛选本土优良冰酒酵母菌株奠定基础。主要的研究结果如下：一、美乐（Merlot）冰红自然发酵和接种发酵共分离到524株酵母菌，得到12种WLN培养类型，经鉴定其分属于6属6种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）、耐热克鲁维酵母（Lachancea thermotolerans旧称Kluyveromyces thermotolerans）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、核果梅奇酵母(Metschnikowia aff. fructicola）、亚膜汉逊酵母（Pichia subpelliculosa），分别占到了分离总菌株的65.5%、2.7%、19.1%、9.9%、0.2%、2.7%。其中，菌落类型A（S.cerevisiae）和D（H. uvarum）均有两个不同形态；菌落类型B（T.delbrueckii）和C（L.thermotolerans）均有三个不同形态。贵人香（Italian Riesling）冰白自然发酵和接种发酵分离到的690株酵母菌，共得到14种WLN培养类型，经鉴定其分属于6属8种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）、戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、耐热克鲁维酵母（Lachancea thermotolerans旧称Kluyveromyces thermotolerans）、核果梅奇酵母（Metschnikowia aff. fructicola）、嗜高压有孢汉生酵母（Hanseniaspora osmophila）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe），分别占到了分离总菌株的90.58%、2.46%、1.01%、1.45%、2.90%、0.29%、0.86%、0.43%。其中，菌落类型Cc（T.delbrueckii）和Gg（H. osmophila）均有两个不同形态；菌落类型Aa（S. cerevisiae）和Ee（L. thermotolerans）均有三个不同形态。二、对美乐冰红发酵过程中不同阶段菌株种类及变化进行研究，结果表明发酵不同阶段酵母菌种类存在有规律的消长，非酿酒酵母在糖度较高的美乐冰红发酵中表现出了一定的竞争力并启动了冰红发酵。在美乐冰酒葡萄原料破碎汁中存在大量的非酿酒酵母（49.3%），主要有T. delbrueckii（17.6%）和L. thermotolerans（30.4%）。在美乐冰红自然发酵中，启酵以后，酿酒酵母所占比例不是很高（31.6%），而非酿酒酵母在这个时期迅速增长（68.4%），是启动发酵的主要菌种，尤其是L. thermotolerans和H. uvarum（占35.6%和26.9%），更是成为启动发酵的优势菌种。到发酵中期，随着发酵过程中乙醇的产生，非酿酒酵母急剧减少，S. cerevisiae由于良好的酒精耐受力，其菌落密度和所占比例都呈迅速增长状态，占据主导地位（92.3%）。到发酵后期非酿酒酵母全部消亡，S. cerevisiae成为主要发酵群体（100%）并主导发酵直至结束。美乐冰红接种发酵在启酵以后，酿酒酵母只占到这个时期的5.3%；非酿酒酵母占94.7%，L. thermotolerans和H. uvarum在接种发酵中表现出了比自然发酵中更强的活力（平均占48.9%和27.5%），成为发酵启动时的优势菌种。到了发酵中期，酿酒酵母逐步适应环境、迅速生长，替代非酿酒酵母成为优势菌株，同时，非酿酒酵母逐渐减少和死亡，比例下降到13.4%，还保有一定的活力。到发酵后期非酿酒酵母全部消亡，S. cerevisiae成为主要发酵群体（100%）主导发酵直至结束。贵人香冰白发酵过程中，不同阶段酵母菌种类也存在有规律的消长，非酿酒酵母在贵人香冰白发酵中的竞争能力较弱，起酵以后就逐渐减少和死亡。贵人香冰酒葡萄原料破碎汁的非酿酒酵母种类较丰富，包括S. uvarum、T. delbrueckii、L. thermotolerans、M.fructicol、H. osmophila、S. pombe，其中S. uvarum（32.6%）和S. pombe（5.4%）只在破碎汁中被检测到。到了启酵阶段，酿酒酵母占据了主导地位（96.0%）；一直到发酵结束，酿酒酵母都保持着绝对优势，是冰白发酵的主导菌株。在接种发酵中酿酒酵母更是起了主导作用，在接种发酵的4个时期（T2、T3、T4、T5）分别占93.2%、91.0%、88.4%、99.0%。三：从美乐冰红自然发酵和接种发酵分离获得的343株酿酒酵母中随机选取125株单菌落进行Interdelta指纹图谱分析，共获得12种基因型G1-G12，分别占总比例的7.1%、54.8%、2.4%、12.7%、12.7%、4.0%、0.8%、0.8%、0.8%、0.8%、1.6%、0.8%。贵人香冰白自然发酵和接种发酵分离到的625株酿酒酵母中随机选取211株单菌落进行Interdelta指纹图谱分析，共获得18种基因型g1-g18，分别占总比例的12.3%、4.3%、6.2%、8.1%、32.2%、14.2%、2.8%、1.4%、4.7%、5.2%、4.7%、0.9%、0.5%、0.5%、0.5%、0.5%、0.5%、0.5%。基因型G8、G2、G4分别和基因型g1、g3、g17一样，为这两个品种发酵共有的酿酒酵母基因型。综合比较各基因型所占分离总菌数的比例、竞争力、生长持续性、完成发酵的贡献等方面，美乐和贵人香冰酒发酵共得到优势基因型9种（G1、G2、G4、G5、G11、g1、g4、g5、g6），可进一步重点进行这些基因型菌株的发酵特性研究，为优良菌株的筛选奠定基础。美乐和贵人香接种发酵中均未检测到接入的商业酵母的基因型，故试验中接入的商业酵母未能触动和/或主导冰酒发酵的进行，发酵由野生酵母完成；也未检测到葡萄酒厂所采用的商业酵母。

全文目录


摘要  5-8
ABSTRACT  8-13
第一章 文献综述  13-23
  1.1 冰葡萄酒的研究现状  13-16
    1.1.1 冰酒的定义  13
    1.1.2 冰酒在国内外的研究现状  13-14
    1.1.3 冰酒酵母的研究  14-16
  1.2 葡萄酒相关酵母菌  16-18
    1.2.1 概况  16
    1.2.2 酿酒酵母（Saccharomyces）  16-17
    1.2.3 非酿酒酵母（Non-Saccharomyces）  17-18
  1.3 酵母选育  18-20
    1.3.1 优良葡萄酒酵母的来源  18-19
    1.3.2 优良葡萄酒酵母的筛选和选育  19
    1.3.3 优良葡萄酒酵母筛选的参考标准  19-20
  1.4 本研究的目的和意义  20-23
    1.4.1 冰酒研究现状及存在的问题  20-21
    1.4.2 本研究的主要内容  21-23
第二章 材料和方法  23-28
  2.1 试验材料  23-24
    2.1.1 菌株及其来源  23-24
  2.2 培养基  24
  2.3 主要仪器和设备  24-25
  2.4 冰酒发酵  25-26
    2.4.1 工艺流程  25
    2.4.2 发酵过程及实验操作  25-26
  2.5 酵母菌的分离、计数和保藏  26
  2.6 菌株纯化、WLN培养基聚类分析  26
  2.7 酵母菌的分子鉴定  26-28
    2.7.1 酿酒酵母菌株基因组DNA提取  26
    2.7.2 Interdelta序列扩增  26-27
    2.7.3 酵母菌26S rDNA D1/D2 区 PCR扩增  27
    2.7.4 数据处理  27-28
第三章 结果与分析  28-48
  3.1 酵母菌株的分类鉴定  28-35
    3.1.1 酵母菌株的WLN培养基聚类分析  28-34
    3.1.2 代表菌株26S rDNA的序列分析  34-35
  3.2 发酵过程中酵母菌的种类及其动态变化  35-41
    3.2.1 美乐冰红发酵酵母菌种类及其动态变化  35-38
    3.2.2 贵人香冰白发酵酵母菌种类及其动态变化  38-41
  3.3 发酵过程中酿酒酵母的菌株分型  41-42
    3.3.1 美乐冰红发酵过程中酿酒酵母的Interdelta指纹图谱分析  41-42
    3.3.2 贵人香冰白发酵过程中酿酒酵母的Interdelta指纹图谱分析  42
  3.4 发酵过程中酿酒酵母的不同基因型的动态变化  42-48
    3.4.1 美乐冰红发酵过程中酿酒酵母的不同基因型菌株的动态变化  42-44
    3.4.2 贵人香冰白发酵过程中酿酒酵母的不同基因型菌株的动态变化  44-48
第四章 讨论  48-53
  4.1 WLN培养基在葡萄酒相关酵母菌鉴定中的应用  48-49
  4.2 冰酒发酵中的非酿酒酵母  49-50
  4.3 冰酒发酵过程中酵母菌的菌群特点  50
  4.4 接种酵母在葡萄酒发酵中的作用  50-53
第五章 结论  53-55
参考文献  55-63
致谢  63-64
作者简介  64
发表论文情况  64

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 酿造工业 > 各种酒及其制造 > 葡萄酒、香槟酒
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