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高压脉冲电场下亚致死酵母的产生及进一步灭活

作　者: 顾艳洁
导　师: 杨瑞金
学　校: 江南大学
专　业: 食品科学
关键词: 酿酒酵母高压脉冲电场亚致死损伤冷激
分类号: TS261.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

高压脉冲电场（PEF）是一种非热加工技术，多用于液态食品的杀菌。目前国内外对PEF的研究主要集中在杀菌钝酶及对果蔬汁营养成分的影响方面，鲜有关于PEF作用下亚致死损伤微生物的检测，PEF作用下亚致死损伤微生物的产生机理尚不清楚。本文以酿酒酵母为研究对象，研究PEF作用下亚致死损伤微生物的检测方法及产生规律，探讨PEF导致酿酒酵母亚致死损伤的机理和进一步致死亚致死损伤酵母细胞的方法。采用非选择性培养基与含有4%NaCl的选择性培养基共同计数对PEF作用下亚致死损伤酿酒酵母的数量进行了检测，证实电场强度为20kV/cm的PEF作用不同时间（100⁵00μs）会有大量的亚致死损伤酵母产生，亚致死损伤比例在58.11%⁸9.54%之间，且亚致死损伤酵母细胞产生的数量与PEF作用时间呈现正相关。采用荧光染色技术结合流式细胞分析仪研究了20kV/cm的PEF作用下亚致死损伤酿酒酵母细胞的细胞膜与核酸（包括DNA和RNA）的损伤；采用超微量Ca²⁺-ATPase试剂盒与APIZYM试剂盒研究了PEF处理后酿酒酵母胞内各种酶活力的变化。研究发现PEF处理会导致酿酒酵母细胞膜通透性增加、流动性降低；总脂肪酸相对含量与未处理组相比从94.74%下降至90.83%；同时会造成部分RNA发生降解，但对酿酒酵母DNA几乎不产生影响。PEF处理可使酿酒酵母体内Ca²⁺-ATPase的活力由0.23mgprot/ml增大至28.57mgprot/ml，同时使碱性磷酸酶、糖苷酶的活力显著上升，酯酶类及芳胺酶类活力略微下降，脂酶变化不显著。研究了0.1%酵母浸粉缓冲液、0.1%蛋白胨缓冲液、0.1%葡萄糖缓冲液三种不同缓冲体系及Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺三种金属离子的存在下亚致死损伤酵母细胞的修复情况。PEF作用导致的亚致死损伤酵母细胞在三种不同的缓冲体系中均可在30⁷0min内完成自我修复；Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺的存在对酿酒酵母有一定的保护作用，并促进了缓冲体系及鲜榨草莓汁中亚致死损伤酵母的修复，促进效果K⁺> Ca²⁺> Mg²⁺。热胁迫蛋白HSP104、海藻糖合成酶TPS1、冷胁迫蛋白TIP1三种应激蛋白对应基因的敲除并不会改变酿酒酵母对PEF处理的敏感性，温度的变化会对PEF作用下的亚致死损伤酵母细胞产生较大负面影响。以HSP104Δ、TPS1Δ、TIP1Δ三种应激蛋白基因缺陷型酵母菌株与野生型酵母菌株WT为研究对象，通过四种水浴温度（4℃、15℃、35℃、55℃）的改变以及4℃冷激处理研究了PEF作用下亚致死损伤酿酒酵母的进一步灭活。研究得到4℃水浴条件更有利于PEF作用下酿酒酵母的致死， PEF处理后1h的4℃冷激处理可使酿酒酵母菌的致死量与未处理组相比增加1.70个对数。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-6
简写对照表  6-9
1 前言  9-14
  1.1 高压脉冲电场  9-11
    1.1.1 高压脉冲电场技术  9
    1.1.2 高压脉冲电场技术的国内外研究现状  9
    1.1.3 高压脉冲电场杀菌机理  9-10
    1.1.4 高压脉冲电场杀菌的影响因素  10-11
  1.2 亚致死微生物  11-12
    1.2.1 PEF 作用下亚致死微生物的产生  11
    1.2.2 亚致死微生物的检测方法  11
    1.2.3 亚致死微生物的国内外研究现状  11-12
  1.3 酿酒酵母  12-13
    1.3.1 酿酒酵母的生理特点  12-13
    1.3.2 酿酒酵母的杀灭与维持食品品质的关系  13
  1.4 立题背景及研究意义  13
  1.5 主要研究内容  13-14
2 材料与方法  14-21
  2.1 实验试剂与设备  14
    2.1.1 主要原料和试剂  14
    2.1.2 主要仪器和设备  14
  2.2 实验方法  14-21
    2.2.1 微生物的活化与接种  14
    2.2.2 微生物计数与亚致死损伤比例的计算  14-15
    2.2.3 PEF 处理  15-16
    2.2.4 热处理  16
    2.2.5 冷激处理  16
    2.2.6 酿酒酵母细胞荧光标记  16-17
      2.2.6.1 PI 标记  16
      2.2.6.2 DPH 标记  16
      2.2.6.3 Rh123/PI 双标记  16-17
      2.2.6.4 cFDA 标记  17
      2.2.6.5 AO 标记  17
    2.2.7 酿酒酵母细胞膜通透性的测定  17
    2.2.8 酿酒酵母细胞膜流动性的测定  17-18
    2.2.9 细胞膜脂质的提取与脂肪酸相对含量的测定  18
    2.2.10 酿酒酵母线粒体膜电位的测定  18
    2.2.11 酿酒酵母酶活力的测定  18-20
    2.2.12 酿酒酵母核酸变化的测定  20
    2.2.13 酿酒酵母核酸的琼脂糖凝胶电泳  20-21
3 结果与讨论  21-47
  3.1 PEF 对酿酒酵母的杀菌效果  21-22
    3.1.1 酿酒酵母的生长曲线  21
    3.1.2 PEF 处理对酿酒酵母的致死及亚致死损伤作用  21-22
  3.2 PEF 处理对酿酒酵母细胞膜的影响  22-28
    3.2.1 PEF 处理对酿酒酵母细胞膜通透性的影响  23
    3.2.2 PEF 处理对酿酒酵母细胞膜流动性的影响  23-25
    3.2.3 PEF 处理对酿酒酵母细胞膜脂质成分的影响  25-26
    3.2.4 PEF 处理对酿酒酵母线粒体膜电位的影响  26-28
  3.3 PEF 处理对酿酒酵母细胞酶活的影响  28-33
    3.3.1 PEF 处理对酿酒酵母细胞 Ca~(2+)-ATP 酶活的影响  28-29
    3.3.2 PEF 处理对酿酒酵母细胞内酯酶活的影响  29-30
    3.3.3 PEF 处理对酿酒酵母胞内酶活的影响  30-33
  3.4 PEF 处理对酿酒酵母核酸的影响  33-35
    3.4.1 PEF 处理对 RNase 处理前酿酒酵母核酸的影响  33-34
    3.4.2 PEF 处理对 RNase 处理后酿酒酵母核酸的影响  34-35
  3.5 PEF 作用下亚致死损伤机制  35-36
  3.6 PEF 作用下亚致死损伤酿酒酵母的修复  36-41
    3.6.1 不同缓冲体系中亚致死损伤酿酒酵母的修复  36-37
    3.6.2 金属离子对亚致死损伤酿酒酵母的修复  37-41
  3.7 应激蛋白缺失对亚致死损伤酿酒酵母的影响  41-44
    3.7.1 不同电场强度对缺陷型酵母菌株存活率的影响  41-42
    3.7.2 PEF 与热处理对缺陷型酵母菌株存活率的影响  42-44
  3.8 PEF 处理导致亚致死损伤酿酒酵母的进一步灭活  44-47
    3.8.1 PEF 处理与不同水浴温度协同作用  44-45
    3.8.2 PEF 处理与冷激协同作用  45-47
主要结论  47-48
展望  48-49
致谢  49-50
参考文献  50-55
附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文  55

高压脉冲电场下亚致死酵母的产生及进一步灭活

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