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花生过敏原的DNA生物传感检测方法的建立

作　者: 管露
导　师: 孙秀兰
学　校: 江南大学
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 食物过敏花生过敏原电化学DNA传感器茎环探针
分类号: TS207
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

花生过敏可引起肠胃不适、过敏性皮炎等过敏反应，严重的甚至会发生过敏性休克和过敏性死亡。目前国内外对花生过敏性疾病尚无有效的治疗方法。为此，避免敏感人群食入含花生的食物是目前公认的最有效的预防花生过敏的手段。因此，研究建立花生过敏原的快速、灵敏的检测方法具有重要意义。相比于蛋白，DNA在加热、压力等加工处理条件下能较长时间保持稳定，因此残留的花生致敏原DNA能更好地表示食品中致敏原的存在状态。针对花生主要过敏原Ara h1，文章通过合成该基因特异性的分子信标状的茎环探针和与探针互补的目标序列，基于DNA杂交的原理，建立了三种电化学DNA传感器。1、将茎环探针和6-巯基己醇自组装到金电极的表面，构建一种简单的、无放大的DNA传感器。并应用电化学交流阻抗谱进行定量测定，可实现目的基因的高灵敏检测，检测范围在10^-15mol/L到10^-10mol/L内，检测限为3.5×10^-16mol/L。将该方法用于花生牛奶饮料中Ara h1基因的检测，浓度为（3.23±0.20）×10^-13mol/L，加标回收率在72.9%¹00.2%，相对标准偏差则在5.1%⁷.9%。2、通过在玻碳电极表面交替电沉积石墨烯和金纳米粒子，以形成多层石墨烯-金纳米复合材料。经过该复合材料和金膜修饰的DNA传感器，用差分脉冲伏安法检测具有更高的灵敏度，其线性范围为1.0×10^-16mol/L到1.0×10^-13mol/L，检测限达4.1×10^-17mol/L。将该方法用于花生牛奶饮料的加标回收测试，回收率为86.8%¹10.4%，相对标准偏差则为2.3%⁶.7%。该方法有效的提高了回收率、灵敏度和特异性。3、将海绵状金膜固定于壳聚糖-多壁碳纳米管复合物（CS-MWCNT）修饰的玻碳电极表面，自组装茎环探针后制成电化学DNA传感器，经过辣根过氧化物酶（HRP）的催化信号放大作用，用电流-时间曲线方法检测测试液中H2O2的氧化还原信号，实现了对目的基因的超灵敏检测。该方法的检测范围在3.91×10^-17mol/L到1.25×10^-15mol/L之间，检测限为1.3×10^-17mol/L。将该方法应用于花生中Ara h1基因的检测，浓度为（2.74±0.11）×10^-11mol/L。虽然该方法灵敏度最高，但稳定性稍差。上述三种DNA传感检测方法的特异性都较好，也具有可再生性和稳定性。由于电极表面修饰的纳米材料与酶的放大作用，使电子传递速率加快，因此这三种电化学传感检测方法的灵敏度逐渐增加，但检测范围却逐渐变窄。另外文章中还建立了SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR方法，来验证电化学DNA传感检测方法定量的可靠性。结果显示所建立的DNA传感器定量检测比较可靠。本实验所建立的电化学茎环DNA传感检测方法，都可应用于食品样品中Ara h1基因的检测，具有良好的发展前景，为食品中过敏原的检测方法提供了思路。

花生过敏原的DNA生物传感检测方法的建立

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