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广西木薯的抗寒性与抗寒育种的初步研究

作　者: 但忠
导　师: 蒋盛军
学　校: 海南大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 抗寒育种 胚挽救技术 Delphi评定法 SAD基因 木薯
分类号: S533
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


木薯(Manihot esculenta Crantz)是大戟科(Euphorbiaceae)灌木状多年生作物,并广泛种植于我国的热带、亚热带地区。近年来,木薯主要被用于生产燃料乙醇,使得木薯产业显示出极大的发展潜力。但是由于耐寒能力差,限制了木薯栽培的北移,进而限制了木薯种植面积的扩大。因此,木薯抗寒育种成为木薯研究的重要方向。本文对木薯的抗寒育种进行了初步研究,旨在建立了从木薯耐寒种质筛选、幼胚的挽救及杂交后代的抗寒性评定的抗寒育种体系,并在此基础上克隆了F1代的SAD基因片段。以期为木薯抗寒常规杂交育种及转基因育种研究打下理论基础和实际科学数据。主要结果如下：1广西木薯座果的调查分析：对广西武鸣80个木薯品种(品系)的花序、分枝和座果果数量进行了调查。结果发现：在80个木薯品种(品系)中,有73.75%的品种(品系)正常开花,95.00%自然分枝,47.50%正常座果；并通过SAS软件对分枝数量与花序数量分析,发现二者存在正相关。2耐寒种质资源筛选：通过对广西木薯基地能够正常座果的38个品种(品系)的种茎变色度观察以及叶片电解质渗透率的测定,筛选出耐寒能力较强的4个品种(品系),分别为华南6号、D346、E144、B1。3木薯幼胚的挽救：通过统计胚培养后幼胚的褐变率和污染率,选择合适胚龄的幼胚作为最适外植体。试验表明授粉后30天的幼胚可以作为幼胚组织培养的材料。通过对影响幼胚不定芽发生的各种因素的比较和筛选试验,获得了比较适合幼胚不定芽诱导的培养基,即为1／3MS+0.5mg／L6-BA+3 mg／LAgN03+0.5mg/LIBA+20g／L蔗糖。在该培养基上4个木薯品种(品系)的幼胚均能诱导出不定芽,且平均诱导率为53.3%。通过对影响木薯幼胚胚胎发生的各种因素的比较和筛选试验,表明激素NAA比2,4-D更容易诱导出愈伤组织。获得了比较适合木薯幼胚愈伤诱导的培养基,即为1／3 MS+8 mg／L NAA+20g／L蔗糖,在该培养基上4个木薯品种(品系)的幼胚均能诱导出愈伤组织,其中E144愈伤诱导率最高,达62.5%。4 F1代抗寒性的评定及亲缘关系鉴定：通过对24个F1代木薯植株的叶片的萎焉、变色程度观察进行分级,并用Delphi法评定木薯叶片耐寒性生理指标,筛选出6个抗寒性较强的F1代植株。对6个抗寒性较强F1代木薯植株的主要性状进行观察,试验表明F1代分枝部位较高,分枝角度较大。再经聚类分析得出了6个F1代的亲缘关系。5 F1代SAD基因的克隆与生物信息学分析：从木薯F1代组培苗的叶片中提取总DNA。在NCBI上,通过Blast比较蓖麻和拟南芥SAD基因片段获得的保守序列,并设计引物：上游引物P1(5’-TGGCTCTCAAGCTCAATCCT-3’),下游引物P1’(5’-TCTCGGCCATCATACATCAA-3’)。经过特异PCR扩增,获得了长度为361bp的基因片段。将该基因片段经同源性比对分析,结果表明从6个F1代植株扩增得到的目标片段序列同源性很高。将该基因片段的核苷酸序列与麻风树和蓖麻的mRNA序列进行同源比对,同源性分别为82%、92%,初步确定所扩增得到的基因片段为木薯的SAD基因片段。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-12
Ⅰ 文献综述  12-22
  1 木薯概述  12-13
    1.1 特征特性  12-13
    1.2 木薯的用途及产业化前景  13
      1.2.1 木薯的主要用途  13
      1.2.2 木薯产业化前景  13
  2 幼胚的挽救技术在育种中的研究进展  13-14
  3 抗寒育种的研究进展  14-20
    3.1 耐寒种质资源筛选  15
    3.2 耐寒种质的筛选方法及机理  15-16
      3.2.1 人工冷冻鉴定法  15
      3.2.2 电导率法测定植物抗寒力  15
      3.2.3 生理生化指标变化测定植物抗寒力  15-16
    3.3 抗寒育种的途径  16-18
      3.3.1 实生选种  16
      3.3.2 杂交育种  16-17
      3.3.3 诱变育种  17
      3.3.4 分子生物技术育种  17-18
    3.4 木薯的抗寒育种研究进展  18-20
      3.4.1 木薯耐寒种质资源的筛选研究  18
      3.4.2 木薯抗寒常规育种的研究进展  18-19
      3.4.3 木薯分子育种的研究进展  19-20
  4 本研究的目的、意义  20-21
  5 技术路线  21-22
Ⅱ 材料与方法  22-37
  1 广西武鸣县开花结果调查现状分析  22
    1.1 试验材料  22
    1.2 试验方法  22
    1.3 分析方法  22
  2 木薯抗寒种质资源的鉴定  22-23
    2.1 试验材料  22
    2.2 外部受害程度观察  22-23
    2.3 各个木薯品种(品系)叶片电解质的测定  23
      2.3.1 试验材料  23
      2.3.2 试验方法  23
  3 耐寒种质杂交后代幼胚的挽救  23-27
    3.1 试验材料  23-24
    3.2 试验试剂  24-25
    3.3 试验方法  25-27
      3.3.1 外植体预处理及表面消毒  25
      3.3.2 幼胚子叶不定芽的发生  25-26
      3.3.3 不定芽的增殖  26
      3.3.4 幼胚愈伤组织和胚状体的诱导  26
      3.3.5 成苗培养  26-27
      3.3.6 炼苗移栽  27
  4 F1代的组织培养苗的低温胁迫处理、外部形态观察及冷害分级  27-28
    4.1 试验材料  27
    4.2 试验方法  27-28
  5 杂交后代的抗寒生理指标检测及DELPHI法评定抗寒强弱  28-33
    5.1 试验材料  28
    5.2 试验方法  28
    5.3 生理指标测定方法  28-32
      5.3.1 电解质的测定  28
      5.3.2 可溶性糖的测定  28-29
      5.3.3 MDA含量的测定  29
      5.3.4 脯氨酸含量的测定  29-30
      5.3.5 CAT酶活性的测定  30-31
      5.3.6 SOD酶活性的测定  31-32
      5.3.7 POD酶活性的测定  32
    5.4 分析方法  32-33
  6 F1代大田外部性状的观察记录  33
    6.1 试验材料  33
    6.2 试验及分析方法  33
  7 F1代SAD基因的克隆与序列比对  33-37
    7.1 主要试剂和仪器  33
    7.2 试验材料  33
    7.3 试验方法  33-37
      7.3.1 木薯DNA提取  33-34
      7.3.2 DNA质量的检测  34
      7.3.3 DNA的纯化  34
      7.3.4 PCR扩增反应及扩增程序  34-35
      7.3.5 SAD基因的回收及纯化  35-36
      7.3.6 测序与序列分析  36-37
Ⅲ 结果与分析  37-53
  1 广西开花结果调查分析  37-39
    1.1 开花调查结果与分析  37
    1.2 分叉(分枝)调查结果与分析  37-38
    1.3 分叉(分枝)数与花序数相关性分析  38-39
    1.4 座果数量调查结果与分析  39
  2. 广西武鸣县木薯种质圃耐寒品种(系)调查分析  39-41
    2.1 耐寒种质资源的受害程度调查结果  39-40
    2.3 各个木薯品种(品系)叶片电解质的测定  40-41
  3 耐寒种质杂交后代幼胚的挽救  41-47
    3.1 取材季节对外植体建立的影响  41-42
    3.2 木薯幼胚的子叶不定芽的再生过程  42-44
      3.2.1 不同种类生长调节剂(6-BA、IBA)浓度对幼胚不定芽发生的影响  43
      3.2.2 不定芽诱导最适培养基的筛选  43-44
    3.3 木薯幼胚的胚状体发生过程  44-47
      3.3.1 不同基本培养基对木薯幼胚愈伤组织诱导的影响  45
      3.3.2 不同植物生长激素种类及浓度对愈伤组织诱导的影响  45-46
      3.3.3 幼胚愈伤诱导的最适培养基的筛选  46-47
  4 F1代的抗寒性检测  47-49
    4.1 组织培养苗的低温胁迫处理、外部形态观察及冷害分级  47-48
    4.2 F1代的抗寒生理指标检测及DELPHI法评定抗寒强弱  48-49
  5 F1代大田外部性状的观察记录  49-50
  6 杂交后代SAD基因的克隆与序列比对  50-53
    6.1 6个木薯F1代总DNA的提取  50-51
    6.2 木薯SAD基因特异引物设计与筛选  51-52
    6.3 6个木薯F1代SAD基因的克隆  52
    6.4 6个F1代木薯植株与其他植物的SAD基因同源性分析  52-53
Ⅳ 讨论  53-58
  1 关于广西武鸣县开花结果调查现状分析  53-54
  2 关于广西木薯耐寒种质资源的评选  54
  3 关于木薯幼胚的挽救  54-55
  4 F1代的抗寒性检测  55-56
  5 杂交后代SAD基因的克隆与序列比对  56-58
Ⅴ 结论  58-59
参考文献  59-64
附表  64-66
缩略语  66-67
致谢  67

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 薯类作物 > 木薯（树薯）
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