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抗非特异性蛋白质吸附多肽的合成、表征及体外酶降解性能研究

作　者: 杨庆华
导　师: 陈圣福
学　校: 浙江大学
专　业: 应用化学
关键词: 多肽抗非特异性蛋白质吸附生物相容性可控酶降解
分类号: TQ460.1
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

生物材料与普通的材料的一个根本区别在于其生物相容性。生物相容性不仅包括组织相容性,不会使组织产生炎症甚至免疫原性；而且包括血液相容性,即不会产生凝血和血栓现象。聚乙二醇(PEG)是为数不多的经过美国食品药品监督管理局(FDA)批准能够应用于临床的医用生物材料,但是已经证明其在长期体内环境条件下容易氧化,失效甚至引起血栓等严重后果。传统两性离子材料如聚甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(pMPC)、聚磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(pSBMA)和聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(pCBMA)具有优良的抗非特异性吸附性能和生物相容性,但是由于其甲基丙烯酸酯类的聚合物骨架不能生物降解,这限制了它们在药物与基因载体等领域的应用。因此,我们开发了若干具有优异抗非特异性蛋白质吸附性能的多肽,并综合考察了它们的各种性能,尤其是酶降解性能。主要的内容和结论包括以下几个部分：1、以Nε-苄氧羰基-α-叔丁基-L-赖氨酸盐酸盐(H-Lys (Z)-OtBu.HCl)和δ-苄基-N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸(Boc-Glu(Z)-OH)作为起始原料,合成了具有均一正负电荷分布的多肽(poly(EK),对应二聚体称dimer1)抗非特异性蛋白质吸附材料,解决了N-羧基环状酸酐(NCA)单体混聚所产生的不均一性和PEG类和甲基丙烯酸酯类材料的生物不可降解性问题。核磁共振图谱(1HNMR)和凝胶渗透色谱(GPC)检测结果表明已经成功得到不同分子量的poly(EK).以dimer1作为原料,典型的poly(EK)收率为45%左右。衰减全反射傅立叶转换红外光谱(ATR-FTIR)、X-射线光电子谱(XPS)以及椭圆偏振光谱仪(Ellipsometer, ELL)检测结果表明在金片表面存在多肽的自组装单分子膜(SAMs). ELL测定的SAMs膜厚大约只有几纳米,且随着多肽的分子量呈非线性增加。以TCPS表面作为对照,SAMs表面对anti-IgG和Fg的最低相对吸附量只有5.1±1.6%和7.3±1.8%,表明该多肽具有良好的抗非特异性蛋白质吸附性能。没有发现明显的细菌和细胞吸附。在5mg/mL情况下,poly(EK)没有发现明显的细胞毒性和溶血现象。2、以α-苄基-Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸盐酸盐(H-Lys(Z)-OBzl.HCl)和α-叔丁基-N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸(BOC-Glu-O’Bu)作为起始原料,我们合成了一种具有聚谷氨酸骨架带赖氨酸侧链的多肽(poly(E)-K,对应二聚体称dimer2)。1HNMR和GPC的检测结果表明得到了不同分子量的目标多肽。以dimer2作为原料,典型的poly(E)-K的收率为40%左右。ATR-FTIR、XPS以及ELL的检测结果都证实了金片表面存在多肽SAMs.以TCPS表面作为对照,该多肽SAMs (3.5kDa)对anti-IgG和Fg的最低吸附量只有3.3±1.8%和4.4±1.6%,具有比poly(EK)更好的抗非特异性蛋白质吸附性能。在5mg/mL的情况下,poly(E)-K也没有发现明显的细胞毒性和溶血性能。在溶血性实验中,poly(E)-K的吸光度甚至低于阴性对照组PBS的吸光度,表明它对细胞膜的作用很小,甚至可能还有一定的保护作用。3、预备实验发现,由a-氨基和α-羧基正常接肽的poly(EK)可以被胰蛋白酶降解；而聚合物骨架与侧链之间通过γ-羧基与a-氨基非正常接肽而成的poly(E)-K,则不能被胰蛋白酶降解。在此基础上,通过调节两种二聚体的比例,缩合得到不同比例的混聚多肽。]HNMR的检测结果表明,已经成功得到不同比例的混聚多肽。初步酶降解实验结果显示,随着poly(E)-K的比例不断增加,混聚多肽的酶降解时间有一定程度的延长。因此,通过调节混聚多肽的组成,可以方便调控其酶降解速度和时间,这在药物／基因控制释放,以及组织工程等方面有广阔的应用前景。

全文目录

致谢  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-15
第一章绪论  15-64
  1.1 引言  15
  1.2 常见的抗非特异性蛋白质吸附材料  15-36
    1.2.1 聚乙二醇(PEG)类抗非特异性蛋白质吸附材料  17-20
    1.2.2 羧基甜菜碱(CBMA)类抗非特异性蛋白质吸附材料  20-25
    1.2.3 磺酸基甜菜碱(SBMA)类抗非特异性蛋白质吸附材料  25-28
    1.2.4 磷酰胆碱(MPC)类抗非特异性蛋白质吸附材料  28-32
    1.2.5 含氨基酸的抗非特异性蛋白质吸附材料  32-34
    1.2.6 混合型两性离子抗非特异性蛋白质吸附材料  34-36
  1.3 抗非特异性蛋白质吸附材料的作用机理研究状况概述  36-39
  1.4 多肽的合成方法概述  39-48
    1.4.1 固相多肽合成方法  40-41
    1.4.2 N-羧基环状酸酐(NCA)的开环聚合  41-44
    1.4.3 缩合的方法  44-48
  1.5 多肽或蛋白质的酶降解性能研究概述  48-51
  1.6 本研究工作的主要内容  51-52
  1.7 参考文献  52-64
第二章具均一正负电荷结构的抗非特异性蛋白质吸附多肽材料的制备与性能表征  64-91
  2.1 引言  64-67
  2.2 实验部分  67-75
    2.2.1 实验试剂  67-68
    2.2.2 实验仪器  68
    2.2.3 具均一正负电荷的多肽(poly(EK))的合成  68-71
    2.2.4 凝胶渗透色谱(GPC)分析  71
    2.2.5 ATR-FTIR测定SAM的结构以及ELL测定膜的厚度  71-72
    2.2.6 XPS分析  72
    2.2.7 SAMs的抗非特异性蛋白质吸附性能测定  72-73
    2.2.8 圆二色(CD)的测定  73
    2.2.9 细菌的吸附实验  73
    2.2.10 细胞的吸附实验  73-74
    2.2.11 MTT分析  74
    2.2.12 溶血实验  74-75
  2.3 结果与讨论  75-87
    2.3.1 目标多肽(poly(EK))的合成  75-77
    2.3.2 SAMs的ATR-FTIR、XPS以及ELL表征  77-82
    2.3.3 SAMs表面的抗非特异性蛋白质吸附性能的测定  82-83
    2.3.4 细胞和细菌在SAMs表面的吸附性能测定  83-85
    2.3.5 Poly(EK)的MTT和溶血性能考察  85-87
  2.4 结论  87-88
  2.5 参考文献  88-91
第三章以聚谷氨酸为骨架带赖氨酸侧链的抗非特异性蛋白质吸附多肽材料的制备与性能表征  91-112
  3.1 引言  91-93
  3.2 实验部分  93-99
    3.2.1 实验试剂  93-94
    3.2.2 实验仪器  94
    3.2.3 目标多肽(poly(E)-K)的合成  94-97
    3.2.4 凝胶渗透色谱(GPC)分析  97
    3.2.5 SAMs的ATR-FTIR、XPS以及ELL分析  97
    3.2.6 SAMs的抗非特异性蛋白质吸附性能测定  97-98
    3.2.7 MTT分析  98
    3.2.8 溶血实验  98-99
  3.3 结果与讨论  99-108
    3.3.1 多肽(poly(E)-K)的合成  99-102
    3.3.2 SAMs的ATR-FTIR、XPS以及ELL表征  102-105
    3.3.3 SAMs的抗非特异性蛋白质吸附性能测定  105-107
    3.3.4 MTT毒性和溶血性能考察  107-108
  3.4 结论  108-109
  3.5 参考文献  109-112
第四章可控酶降解多肽共聚物制备与体外酶降解性能研究  112-127
  4.1 引言  112-113
  4.2 实验部分  113-116
    4.2.1 实验试剂  113
    4.2.2 实验仪器  113-114
    4.2.3 各种多肽的合成  114-115
    4.2.4 具有不同比例的混聚多肽酶降解  115-116
  4.3 结果与讨论  116-124
    4.3.1 各种多肽的核磁共振图谱  116-120
    4.3.2 Poly(EK)与Poly(E)-K的酶降解图谱  120-121
    4.3.3 含不同百分比poly(E)-K的混聚多肽的酶降解图谱  121-124
  4.4 结论  124
  4.5 参考文献  124-127
第五章全文总结  127-131
  5.1 全文的主要结论  127-129
  5.2 全文的主要特色与创新点  129
  5.3 存在的问题与展望  129-131
    5.3.1 存在的主要问题  129-130
    5.3.2 今后的工作展望  130-131
作者简介  131
攻读博士学位期间的主要研究成果  131

抗非特异性蛋白质吸附多肽的合成、表征及体外酶降解性能研究

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