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黄渤海中华哲水蚤现场食物的分子生物学分析方法及应用

作　者: 衣晓燕
导　师: 刘光兴
学　校: 中国海洋大学
专　业: 环境科学
关键词: 中华哲水蚤纤毛虫现场食物 18S rDNA 黄渤海
分类号: Q958.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

桡足类是海洋浮游动物的优势类群，是海洋生态系统中的重要摄食者，开展桡足类摄食研究，对于揭示其与浮游植物等的相互作用规律，探究其在海洋生态系统物质循环和能量流动中的作用具有重要意义。有关浮游动物及桡足类摄食研究方法的研发，也是摄食生态学研究的重点之一。本论文所探索的分子生物学方法是研究桡足类摄食的一种新的尝试，与以往研究桡足类摄食的饵料浓度差减法、同位素示踪法和肠内含物色素分析法等方法相比，分子生物学方法避免了传统方法的一些缺点和局限，结果可更好地反映桡足类现场摄食的真实情况，具有独特的优势。本文主要包括两部分，一部分是以阻断偏口虫纤毛虫 18S rDNA基因为目的，设计纤毛虫阻断引物和探索适宜的PCR阻断条件；另一部分是以黄渤海常见的桡足类-中华哲水蚤(Calanus sinicus)作为研究对象，利用基于PCR的分子生物学检测方法，高效地特异性扩增中华哲水蚤饵料生物的18S rDNA，揭示其现场食物的基本组成。纤毛虫是原生动物中的常见种，有些种类会寄生在桡足类的体表或组织内部，在PCR扩增饵料生物18S rDNA基因的同时得到的纤毛虫基因无法忽略，这种现象会影响分子生物学方法通过基因多样性来判断生物组成的高效性。本研究通过设计三种纤毛虫阻断引物和现有的18S non-copepod引物，最大限度地特异性扩增除桡足类之外的真核生物的18S rDNA基因，在对不同地理位置中华哲水蚤的现场食物组成进行分析的基础上，对中华哲水蚤的摄食选择性的问题进行研究，探索建立适于检测桡足类现场食物信息的技术，更为准确地检测海洋桡足类的现场食物组成、反映自然海区中桡足类与浮游植物的营养关系，为真实地揭示桡足类在海洋食物网中的作用提供新型实用快速的检测方法。基于PCR扩增的分子生物学分析方法，研究设计了纤毛虫基因的阻断实验，对三种阻断引物的阻断效果进行了测试和比对，在纤毛虫基因能够很好地被阻断的情况下，确定了最优的阻断引物和PCR反应条件。研究中通过提取三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum），球等鞭金藻（Isochrysis galbana）和3种桡足类：中华哲水蚤（Calanus sinicus）、太平洋纺锤水蚤（Acatia pacifica）和背针胸刺水蚤（Centropages dorsispinatus）的基因组基因，获得了三角褐指藻和纤毛虫的18S rDNA基因，作为内标基因的硅藻基因与纤毛虫基因等比例混合，加入不同的纤毛虫阻断引物，在不同的PCR反应条件下进行阻断，通过比较凝胶电泳图像上各个电泳条带的强弱，反映了纤毛虫18S rDNA被阻断的情况。结果表明：最优的阻断引物为Ciliate18Sblk1，具有较好阻断效果的阻断条件为：3min at94°C；5cycles of10sec at95°C，60sec at68°C；30cycles of95°C for10sec，54.2°Cfor30sec，72°C for40sec；10min at72°C。在上述研究基础上采用18S non-copepod引物和Ciliate18Sblk1纤毛虫阻断引物对黄渤海水域的中华哲水蚤饵料生物的18S rDNA进行扩增，对中华哲水蚤的饵料食物多样性进行了研究。对筛选出的103条18S rDNA序列进行分析，结果显示，6月份黄渤海中华哲水蚤的饵料食物组成包括甲藻，硅藻，金藻，隐藻，裸藻；也很有可能包括水母类、箭虫、海胆以及文昌鱼的卵、幼体或者是其残体有机碎屑颗粒。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
1 前言  11-18
  1.1 海洋浮游桡足类的研究背景  11-12
  1.2 海洋浮游桡足类的摄食行为研究进展  12-14
  1.3 DNA 基因序列分析在桡足类研究中的应用  14-16
  1.4 本文研究的目的和意义  16-18
2 海洋浮游桡足类寄生性纤毛虫 18S rDNA 基因扩增的阻断  18-43
  2.1 研究背景  18-19
    2.1.1 纤毛虫的背景介绍  18
    2.1.2 寄生性纤毛虫对海洋浮游桡足类的影响  18-19
  2.2 材料与方法  19-35
    2.2.1 材料  19-20
    2.2.2 主要仪器设备  20
    2.2.3 主要试剂及其配制  20-23
    2.2.4 样品采集固定和实验室处理  23-25
    2.2.5 阻断引物的设计  25
    2.2.6 总基因组 DNA 的提取  25-26
    2.2.7 琼脂糖凝胶电泳  26-27
    2.2.8 18S rDNA 的 PCR 扩增及测序  27-31
    2.2.9 阻断引物和阻断条件的测试  31-35
  2.3 研究结果  35-41
    2.3.1 藻类 18S rDNA 提取及纯化  35-36
    2.3.2 寄生性纤毛虫 18S rDNA 提取及纯化  36-38
    2.3.3 寄生性纤毛虫 18S rDNA 的阻断  38-41
  2.4 讨论分析  41-43
    2.4.1 最优阻断引物和退火条件  41
    2.4.2 纤毛虫和硅藻 18S rDNA 基因的浓度估算  41-42
    2.4.3 阻断效率的分析以及研究存在的问题  42-43
3 黄渤海中华哲水蚤的现场食物分析  43-62
  3.1 研究背景  43-44
    3.1.1 黄渤海浮游植物的种类分布  43
    3.1.2 分子方法相比较其他传统方法检测的优势  43-44
  3.2 研究材料与方法  44-48
    3.2.1 材料  44
    3.2.2 主要仪器设备  44-45
    3.2.3 主要试剂及其配制  45
    3.2.4 样品采集，固定和实验室处理  45
    3.2.5 中华哲水蚤基因组 DNA 的提取  45-46
    3.2.6 中华哲水蚤饵料食物 18S rDNA 基因的获得  46-47
    3.2.7 序列分析  47-48
  3.3 研究结果  48-57
    3.3.1 中华哲水蚤 18S rDNA 的扩增及纯化  48-49
    3.3.2 序列比对分析  49-53
    3.3.3 N-J 系统进化树的构建  53-56
    3.3.4 中华哲水蚤的现场食物组成  56-57
  3.4 讨论分析  57-62
    3.4.1 中华哲水蚤食物组成的分析  57-60
    3.4.2 研究存在的问题和不足  60-62
参考文献  62-75
致谢  75-76
个人简历  76
在学期间科研情况  76-77

黄渤海中华哲水蚤现场食物的分子生物学分析方法及应用

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