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代谢工程改造酿酒酵母生产单萜的关键问题解析

作　者: 刘继栋
导　师: 陈坚
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 酿酒酵母 无环单萜 单环单萜 麦角固醇 活性氧
分类号: TQ920.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本文以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEN.PK2-1C为研究对象，异源表达了源于植物的单环单萜柠檬烯合成酶（Limonene synthase）及无环单萜香叶醇合成酶（Geraniol synthase），并对单萜合成机理进行了推论。通过改造酿酒酵母甲羟戊酸（Mevalonate, MVA）途径，单萜香叶醇的产量从0.68mg/L提高到了44.13mg/L。研究发现，宿主对单萜的耐受程度较低成为限制单萜产量进一步提高的瓶颈。本文研究了酿酒酵母耐受单萜的机理，为构建一株高单萜耐受性的酵母菌株提供研究依据。主要研究成果如下：1)与单环单萜不同，无环单萜香叶醇合成酶可以直接在酿酒酵母内表达并生成0.47mg/L香叶醇，密码子优化后的香叶醇合成酶具有更高的香叶醇合成效率。在酿酒酵母内表达单环单萜柠檬烯合成酶不能生产柠檬烯，共表达橙花基焦磷酸（Neryldiphosphate, NPP）合成酶与柠檬烯合成酶后实现单环单萜柠檬烯合成酶在酿酒酵母内的表达。共表达NPP合成酶与香叶醇合成酶导致香叶醇产量下降,证实了NPP为单环单萜的合成底物，香叶基焦磷酸（Geranyl diphosphate, GPP）是无环单萜的合成底物。基于此，本研究推论了单萜新的合成机制。2)通过对酿酒酵母体内甲羟戊酸途径及丙酮酸脱氢酶途径关键限速节点的调控，单萜产量从0.68mg/L提高至15.81mg/L。通过过量表达突变后的法尼基焦磷酸（Farnesyldiphosphate, FPP）合成酶编码基因(ERG20K197R)，香叶醇产量提高至37.86mg/L。另外，通过过量表达tRNA合成过程中的转录负调控因子编码基因MAF1，单萜产量进一步提高至44.13mg/L。3)单萜产量的进一步提高受制于宿主对单萜有限的耐受性。为了为构建高单萜耐受性的酵母菌株提供研究方向，本研究通过转录组学分析了酿酒酵母的耐受机制。数据分析表明：在单萜胁迫条件下，酿酒酵母提高了在能量代谢、NADPH再生、抗氧化系统、DNA修复等相关基因在转录水平的表达。同时，编码细胞膜合成相关的基因在表达水平明显上调，表明酿酒酵母提高了其细胞膜合成能力以应对单萜胁迫。此外，胞内调控氧化还原平衡的相关基因在转录水平上调预示着细胞可能经历氧胁迫。4)外源麦角固醇能够显著提高酿酒酵母单萜胁迫下的存活能力，研究证实了外源麦角固醇有利于修复单萜胁迫造成的细胞膜功能损伤。定量PCR证实了外源麦角固醇提高了宿主自身编码麦角固醇合成基因在转录水平的表达量。此外，研究证实酿酒酵母单萜耐受能力与胞内麦角固醇含量呈正相关关系。5)通过研究单萜处理酿酒酵母前后的生理变化，提出并证实了单萜诱发的活性氧（Reactive oxygen species, ROS）胁迫是造成酿酒酵母菌体凋亡的主要因素。本文从酿酒酵母自身抗氧化机制出发研究并证实，胞内酶系及非酶系抗氧化保护系统在单萜胁迫条件下被激活。同时，胞内调控氧化还原平衡的重要辅因子NADPH的含量增加。定量PCR证实，酿酒酵母胞内酶系、非酶系氧化系统及NADPH再生的基因在单萜胁迫下明显上调。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-10
第一章 绪论  10-21
  1.1 概述  10-11
  1.2 国内外研究概况及发展趋势  11-19
    1.2.1 酿酒酵母体内的甲羟戊酸途径  11-14
    1.2.2 甲羟戊酸途径的调控机制  14-15
    1.2.3 酿酒酵母生产萜类的研究进展  15-18
    1.2.4 酿酒酵母耐受单萜机制的研究进展  18-19
  1.3 本论文主要研究内容  19-21
    1.3.1 立题依据和研究意义  19-20
    1.3.2 本论文的主要研究内容  20-21
第二章 酿酒酵母单萜生产平台构建  21-34
  2.1 前言  21-22
  2.2 材料与方法  22-27
    2.2.1 菌株和质粒  22-24
    2.2.2 培养基及培养条件  24-25
    2.2.3 实验主要仪器及耗材  25
    2.2.4 分子生物学操作  25-27
    2.2.5 气相色谱与质谱检测（GC-MS）  27
  2.3 结果  27-32
    2.3.1 在酿酒酵母内表达香叶醇合成酶  27-28
    2.3.2 在酿酒酵母内共表达香叶醇合成酶及 GPP 合成酶  28-29
    2.3.3 在酿酒酵母内表达柠檬烯合成酶未检测出柠檬烯  29-30
    2.3.5 在酿酒酵母内共表达柠檬烯合成酶及 NPP 合成酶  30
    2.3.6 在酿酒酵母内共表达香叶醇合成酶及 NPP 合成酶  30-31
    2.3.7 酿酒酵母内表达单萜合成酶对菌体生长的影响  31-32
  2.4 讨论  32-33
    2.4.1 香叶醇的产量受底物 GPP 供给制约  32
    2.4.2 推论新的酿酒酵母单萜合成机制  32-33
  2.5 本章小结  33-34
第三章 代谢工程改造酿酒酵母过量生产单萜香叶醇  34-45
  3.1 前言  34
  3.2 材料与方法  34-37
    3.2.1 菌株和质粒  34-36
    3.2.2 培养基及培养方法  36
    3.2.3 试剂、酶、引物、Marker 及相关试剂盒  36-37
    3.2.4 分析方法  37
  3.3 结果  37-43
    3.3.1 代谢工程改造酿酒酵母丙酮酸脱氢酶（PD）途径  37-38
    3.3.2 代谢工程改造酿酒酵母 MVA 途径  38-39
    3.3.3 综合改造酿酒酵母 PD 与 MVA 途径  39-40
    3.3.4 过量表达 ERG20K197G对单萜产量的影响  40-41
    3.3.5 降低流经 tRNA 合成途径的代谢通量对单萜产量的影响  41-42
    3.3.6 代谢工程改造对菌体生长的影响  42-43
  3.4 讨论  43-44
    3.4.1 代谢工程改造酿酒酵母 MVA 途径增加代谢通量  43
    3.4.2 代谢工程改造酿酒酵母强化 GPP 供给  43-44
  3.5 本章小结  44-45
第四章 基于转录组学的酿酒酵母单萜胁迫抗性机制解析  45-58
  4.1 前言  45
  4.2 材料与方法  45-47
    4.2.1 菌种与培养条件  45
    4.2.2 单萜处理条件  45
    4.2.3 RNA 的抽提及 Aglient 表达谱芯片的制备  45-46
    4.2.4 cDNA 制备及定量 PCR  46-47
  4.3 结果  47-56
    4.3.1 转录组数据结果  47-54
    4.3.2 定量 PCR 验证  54
    4.3.3 碳代谢及 NADPH 再生途径  54-55
    4.3.4 氨基酸、嘌呤及生物素代谢  55-56
    4.3.5 氧化还原平衡与 DNA 损伤修复  56
  4.4 讨论  56-57
    4.4.1 酿酒酵母增强了单萜胁迫下的细胞膜合成能力  56-57
    4.4.2 酿酒酵母增强了单萜胁迫下调控体内氧化还原平衡的能力  57
  4.5 本章小结  57-58
第五章 依赖于麦角固醇代谢的机制保护酿酒酵母抵御单萜胁迫  58-69
  5.1 前言  58-59
  5.2 材料与方法  59-62
    5.2.1 菌株  59
    5.2.2 培养基及培养条件  59
    5.2.3 单萜处理方法  59
    5.2.4 测定方法  59-62
  5.3 结果  62-66
    5.3.1 外源麦角固醇提高酿酒酵母单萜胁迫下细胞存活能力  62
    5.3.2 胞内麦角固醇含量变化  62-63
    5.3.3 菌体麦角固醇合成能力的变化  63-64
    5.3.4 细胞膜流动性的变化  64-65
    5.3.5 细胞膜通透性的变化  65-66
    5.3.6 细胞膜脂肪酸成分的变化  66
  5.4 讨论  66-67
    5.4.1 外源麦角固醇提高酿酒酵母细胞膜损伤修复能力  66-67
    5.4.2 酿酒酵母单萜耐受能力与其胞内麦角固醇含量呈正相关关系  67
  5.5 本章小结  67-69
第六章 酿酒酵母应对单萜诱发的活性氧胁迫的应答机制  69-81
  6.1 前言  69
  6.2 材料与方法  69-72
    6.2.1 菌株  69-70
    6.2.2 培养基及培养条件  70
    6.2.3 单萜处理条件  70
    6.2.4 测定方法  70-72
  6.3 结果  72-77
    6.3.1 单萜柠檬烯处理对酿酒酵母内外 ROS 水平的影响  72-73
    6.3.2 单萜处理对膜脂氧化程度的影响  73-74
    6.3.3 单萜处理对抗氧化酶活性及总抗氧化能力的影响  74-75
    6.3.4 单萜处理对胞内抗氧化物含量的影响  75
    6.3.5 单萜处理对关键基因转录水平的影响  75-77
    6.3.6 单萜处理对胞内 NADPH 水平的影响  77
  6.4 讨论  77-79
    6.4.1 单萜胁迫诱发的活性氧积累造成酿酒酵母菌体凋亡  77-78
    6.4.2 酿酒酵母单萜胁迫情况下激活了体内抗氧化机制  78-79
  6.5 本章小结  79-81
结论  81-82
论文创新点  82-83
致谢  83-84
参考文献  84-101
附录：作者在读博期间发表的论文  101

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题 > 基础理论
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