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猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立

作　者: 焦洋
导　师: 雷治海；张常印；姜焱
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: TGEV PEDV PBoV 多重PCR 检测
分类号: S852.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病。感染后,主要引起猪的呕吐、腹泻、食欲下降和脱水,各种年龄的猪均易感染。猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis, TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)引起的一种导致猪呕吐、水样腹泻和脱水等主要症状的急性、高度接触性传染病。猪博卡病毒(Porcine bocavirus, PBoV)是2009年新发现的一种细小病毒,属于细小病毒科博卡病毒属。目前已经证实,多种博卡病毒都能够感染并且导致宿主发生急性腹泻。目前的数据表明,PBoV与目前猪的腹泻疫情具有一定的相关性,但是不能证明PBoV是原发性病原或者对其他猪腹泻病毒的爆发起到协同作用。由于TGEV、PEDV这两种病毒临床上呈现出相似的症状,经常会发生混合感染,而PBoV又与腹泻疫情相关。因此,为了评估PBoV对TGEV以及PEDV的流行是否会有加剧的现象,所以需要对这三种病毒进行鉴别诊断。由于临床诊断非常困难,而以往的血清学诊断准确率低,病毒分离诊断方法虽然准确率高,但操作较为复杂。PCR方法较传统检测方法具有快速、特异、灵敏、准确的特点,现今己经广泛应用于动物疫病的鉴别诊断。而多重PCR方法可在同一PCR体系中加入多对引物,可同时对多个目的基因进行扩增。既具有传统PCR方法的优点,又可对同一样品同时检测多种病原,可以达到同步诊断的目的,并且缩短检测时间,减少试剂消耗。为此,本文进行了PEDV、TGEV和PBoV多重PCR检测方法的研究。根据PEDV、TGEV和PBoV的保守基因M、S、NP1分别设计合成了3对特异性引物,成功扩增了这三种基因,在国内首次建立了同时快速鉴别诊断这3种病毒的PCR方法。经过敏感性以及特异性试验,发现本试验方法对PEDV的最高敏感度为20pg, TGEV的最高敏感度为35pg, PBoV的最高敏感度为10pg；并通过对其他几种病毒进行PCR扩增,发现本方法特异性良好,可以应用于临床样品检测。在此基础上,将多重PCR方法与单一PCR方法应用于临床实践中,对2012年送检的120份样品进行了检测(其中90份为腹泻猪粪便样品,30份为健康猪粪便样品)。在90份发病猪样品中,PEDV、TGEV和PBoV的阳性率分别为23.33%、1.11%和22.22%,其中PEDV与PBoV昆合感染的病料有6份,阳性率为6.67%。但在30份健康猪样品中,PBoV的阳性率为16.7%,而PEDV与TGEV的阳性率均为0%。多重PCR方法与单一PCR方法的检测结果一致。上述结果均能证明本文所建立的多重PCR方法灵敏度高、特异性强,可以应用于临床检测。

全文目录

目录  4-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略语及符号  10-11
前言  11-12
第一章猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪博卡病毒检测方法的研究进展  12-22
  1 猪流行性腹泻病毒  12-15
    1.1 概述  12
    1.2 病原学  12-13
    1.3 临床症状及病理变化  13
    1.4 PEDV检测方法研究进展  13-15
  2 猪传染性胃肠炎病毒  15-19
    2.1 概述  15
    2.2 基因组结构  15-17
    2.3 TGEV的变异性  17
    2.4 临床症状及病理变化  17
    2.5 TGEV检测方法研究进展  17-19
  3 猪博卡病毒  19-22
    3.1 概述  19
    3.2 猪博卡病毒的分型  19-20
    3.3 猪博卡病毒的基因组特征分析  20
    3.4 猪博卡病毒的流行情况  20-21
    3.5 PBoV检测方法研究进展  21-22
第二章猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪博卡病毒单一PCR检测方法的建立  22-43
  1 材料  22-24
    1.1 细胞、菌株与毒株  22-23
    1.2 主要试剂  23
    1.3 主要仪器  23
    1.4 主要溶液配方  23-24
  2 方法  24-30
    2.1 PCR引物的设计  24
    2.2 样品及模板制备  24-26
    2.3 PCR反应  26-30
  3 结果  30-42
    3.1 PCR反应条件的优化  30-35
    3.2 单一PCR体系及反应程序的确立  35-36
    3.3 质粒测序结果  36-40
    3.5 PCR反应的特异性  40-41
    3.6 单一PCR反应的重复性  41-42
  4 讨论  42-43
第三章猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用  43-60
  1 材料  43-44
    1.1 细胞、菌株与毒株  43
    1.2 待检组织或病料  43
    1.3 主要试剂  43
    1.4 多重PCR反应条件的优化  43-44
    1.5 样品检测  44
  2 结果  44-56
    2.1 PEDV+TGEV、PEDV+PBoV和TGEV+PBoV双重PCR反应条件的优化  44-50
    2.2 PEDV、TGEV和PBoV三重PCR方法的建立  50-56
  3 样品检测结果  56-58
  4 讨论  58-60
全文总结  60-62
参考文献  62-70
致谢  70-72
硕士学习期间发表的论文  72

猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立

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