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VCIP IRES介导的人溶菌酶与牛γ干扰素共表达腺病毒载体的构建及鉴定

作　者: 承力
导　师: 孙怀昌
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 奶牛乳房炎 IRES GFP LYZ BoIFN-γ 双表达腺病毒载体
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


内部核糖体进入位点(IRES)序列是一种能够独立招募核糖体以表达蛋白的双顺反子序列,在构建多基因共表达载体的过程中发挥着重要作用。溶菌酶(Lysozyme, LYZ)是一种能够水解细胞壁内粘多糖的碱性酶,具有很广的抗菌谱,能够溶解革兰氏阳性细菌和部分革兰氏阴性细菌,甚至病毒也有一定的灭活作用。牛γ-干扰素(BoIFN-y)是细胞在受到适宜的刺激时,在特定的诱生剂作用下,分泌的一种微量的具有抗病毒、影响细胞生长分化、抗肿瘤,调节免疫功能的糖蛋白。因此,LYZ与BoIFN-y的联合使用对于奶牛乳房炎的防治具有很高的利用价值。绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是一种由238个氨基酸组成的具有独特的发光机制的蛋白,最早发现于水母中,是新型的报告基因和定位标记物。腺病毒穿梭载体(Ad vector)因其外源基因表达效率高、瞬间表达,安全性好和易获得高病毒滴度的载体等特点,在基因工程上受到了广泛的应用。为了获得能高效表达人溶菌酶(hLYZ)与牛γ干扰素(BoIFN-γ)的双表达腺病毒载体,本实验分别从人和鼠的基因组中克隆出人胶原诱导蛋白(hVCIP) IRES序列,命名为hIRES和鼠胶原诱导蛋白(mVCIP) IRES序列,命名为mIRES;从含有人溶菌酶基因(hLYZ)的pCDNAK-LYZ载体上PCR扩增出hLYZ序列；从含有GFP基因的pEGFP-N1载体上扩增出GFP序列。经测序正确后,分别插入腺病毒穿梭载体Pshuttle-cmv的相应位点,构建获得Pshuttle-hLYZ-hIRES-GFP和Pshuttle-hLYZ-mIRES-GFP两种重组腺病毒载体。用脂质体法分别转染PK15. AAV293和牛肾细胞,经荧光显微镜观察和FACS检测,结果显示,两种IRES均成功介导了下游基因GFP的表达,不同的细胞中,报告基因GFP的表达量存在较大差别。用BoIFN-y替换GFP基因,获得Pshuttle-hLYZ-mIRES-BoIFN重组腺病毒载体,在AAV-293细胞内包装成腺病毒,经RT-PCR检测,结果表明,本实验成功获得了hLYZ和BoIFN-γ双表达腺病毒。

全文目录


摘要  2-3
Abstract  3-7
符号说明  7-8
综述一  8-18
  1 奶牛乳房炎的危害  8
    1.1 经济损失  8
    1.2 其他损失  8
  2 奶牛乳房炎的病因  8-10
    2.1 病原微生物感染  9
    2.2 营养缺乏  9
    2.3 环境因素  9
    2.4 其他因素  9-10
  3 奶牛乳房炎的类型  10
    3.1 临床型奶牛乳房炎  10
    3.2 隐型奶牛乳房炎  10
  4 诊断方法  10-11
    4.1 临床诊断  10-11
    4.2 实验室诊断方法  11
  5 治疗方法  11-16
    5.1 抗生素  11-12
    5.2 中草药制剂  12-13
    5.3 疫苗防治  13
    5.4 抗菌肽  13
    5.5 干扰素  13-15
    5.6 溶菌酶  15-16
  参考文献  16-18
综述二  18-23
  1 IRES  18-19
    1.1 原理  18
    1.2 来源  18-19
    1.3 应用前景  19
  2 腺病毒载体  19-21
    2.1 腺病毒  19
    2.2 腺病毒基因组  19-20
    2.3 分类  20-21
    2.4 应用及前景  21
  参考文献  21-23
研究内容一  23-36
  摘要  23
  1 材料  23-24
  2 实验方法  24-30
  3 结果  30-35
  4 讨论  35-36
研究内容二  36-42
  摘要  36
  1 材料  36-37
  2 方法  37-38
  3 结果  38-40
  4 讨论  40-42
研究内容三  42-53
  摘要  42
  1 材料  42-43
  2 重组腺病毒载体的构建  43-45
  3 重组腺病毒载体的包装  45-48
  4 结果  48-52
  5 讨论  52-53
致谢  53-54

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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