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古菌冰岛硫化叶菌KMT4/Dot1家族甲基转移酶的生化分析及其活性调节机制研究

作　者: 牛艳玲
导　师: 楼慧强
学　校: 中国农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 染色质蛋白甲基化修饰 KWT4/Dot1 古菌
分类号: Q936
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

真核生物组蛋白存在多种翻译后修饰,这些共价修饰在动态调节染色质结构和基因表达方面发挥着极为重要的作用。组蛋白赖氨酸的甲基化是一种非常重要的表观遗传修饰,广泛存在于所有真核生物中。真核生物复杂的表观遗传机制是否起源于原核生物呢?目前关于表观遗传机制起源和演化的研究还非常少。赖氨酸甲基转移酶主要分为SET和Dotl两个家族。通过PSI-BLAST等生物信息学分析意外发现很多古菌基因组至少编码一个可能的Dotl家族甲基转移酶,命名为aKMT4/Dotl (Archaeal lysine methyltransferase4)。aKMT4在古菌,尤其是在泉古菌中非常保守；而SET家族同源基因G61-SET只存在于极少数甲烷菌中。aKMT4只含有Dotl家族相对较保守的核心结构域,包括AdoMet结合结构域及催化活性中心,而缺乏底物识别结构。我们选择冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)这一古菌模式生物为材料,对aKMT4的理化性质、酶活特性及调节机制进行了较为深入的研究。重组aKMT4蛋白在体外能够甲基化一系列底物,这一结果与其缺乏底物识别结构域相符,同时也和硫化叶菌中普遍的蛋白甲基化修饰现象一致。目前发现的aKMT4底物均为核酸结合蛋白,包括染色质蛋白Sul7d和Cren7、DNA复制蛋白、解旋酶SisMCM、RNA外切酶复合体及核糖体亚基RPL11。这些结果表明aKMT4可能主要参与染色质结构和基因表达的调控。有趣的是,aKMT4对两种不同的RNA外切酶复合体,即Cs14-外切酶体和Rrp4-外切酶体,表现出不同的甲基化方式,这些结果暗示aKMT4可能参与不同RNA外切酶体识别、加工、降解mRNA过程的调节。aKMT4能够对染色质蛋白Su17d和Cren7的多个赖氨酸残基进行单甲基化修饰。MS/MS鉴定结果显示,Cren7体外甲基化谱和天然蛋白甲基化谱高度一致。只有当Cren7的12个赖氨酸全部突变后才完全丧失甲基化,表明aKMT4是一种赖氨酸特异的甲基转移酶,且呈现很低的序列特异性。更有意思的是,当在体外反应中加入DNA时,DNA显著促进aKMT4对Sul7d的甲基化水平,而Cren7的甲基化却不受影响。动力学分析显示,当Su17d与DNA先形成复合物后,aKMT4甲基化Su17d的活性达到最高。MS/MS质谱表明,只有结合DNA后的Su17d体外甲基化谱与体内天然甲基化谱基本一致,这些数据进一步表明aKMT4甲基化染色质结构上的Su17d。以上结果暗示aKMT4至少是负责染色质蛋白甲基化最主要的酶,同时说明虽然aKMT4底物特异性低,但活性很可能受染色质环境等因素的调节。aKMT4还能够进行分子内自甲基化修饰。自甲基化修饰的酶对底物的活性明显降低。突变蛋白aKMT4-8A自甲基化水平显著降低,但催化其它蛋白的活性与野生型相比增加150%以上。此外,在底物存在条件下,自甲基化修饰被抑制,且抑制程度与底物蛋白浓度呈正比。这些结果揭示了一种通过自甲基化来调节甲基转移酶活性的全新机制。综合来说,本研究对首个古菌中普遍存在的甲基转移酶aKMT4进行了较为系统的生化分析,为真核生物组蛋白修饰酶的“原核起源假说”提供了较为翔实的实验证据,且为今后深入开展古菌染色质包括甲基化修饰在内的动态调控的研究奠定了良好的基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-9
缩略词  9-12
第一章引言  12-32
  1.1 染色质概述  12-19
    1.1.1 真核生物的核小体结构  13-14
    1.1.2 古菌的染色体DNA组装、染色质结构及其修饰  14-19
  1.2 组蛋白修饰及对染色质的动态调节  19-30
    1.2.1 组蛋白的甲基化修饰  19-25
    1.2.2 组蛋白的乙酰化修饰  25-28
    1.2.3 组蛋白其它修饰及功能(泛素化和磷酸化修饰)  28-29
    1.2.4 原核染色质蛋白及其修饰  29-30
  1.3 本论文的研究内容和意义  30-32
第二章材料与方法  32-44
  2.1 酶、试剂和抗体  32
  2.2 pET28a-aKMT4载体构建  32
  2.3 pET28a-aKMT4-G38R突变载体的构建  32-33
  2.4 可溶性GST融合蛋白的诱导表达和纯化  33-34
  2.5 可溶性His融合蛋白的诱导表达和纯化  34-35
  2.6 体外甲基化反应  35-36
  2.7 非变性凝胶电泳分析甲基转移酶与底物的体外相互作用  36-37
  2.8 古菌基因组DNA的提取  37
  2.9 凝胶阻滞实验  37-39
  2.10 蛋白质含量测定法(Folin-酚法)  39-40
  2.11 蛋白的超滤和透析  40-41
  2.12 多克隆抗体的制备  41-42
  2.13 抗体的提取与纯化  42
  2.14 质谱分析甲基化修饰位点  42-43
  2.15 分子筛(Gel Filtration)  43-44
第三章硫化叶菌甲基转移酶aKMT4是真核生物Dot1的同源蛋白  44-53
  3.1 背景  44
  3.2 实验结果  44-52
    3.2.1 aKMT4与酿酒酵母yDot1的二级和三级结构是保守的  44-45
    3.2.2 aKMT4甲基化修饰硫化叶菌染色质蛋白Cren7和Sul7d  45-47
    3.2.3 yDot1和aKMT4具有类似的活性中心  47-48
    3.2.4 aKMT4具有结合ssDNA的能力  48-49
    3.2.5 aKMT4部分互补酿酒酵母yDot1的功能  49-51
    3.2.6 aKMT4和Sir2的进化树  51-52
  3.3 小结  52-53
第四章硫化叶菌甲基转移酶aKMT4的酶学特性  53-62
  4.1 背景  53
  4.2 实验结果  53-61
    4.2.1 底物特异性  53-54
    4.2.2 在温度、酶与底物不同摩尔比、pH、时间及离子等不同条件下探究aKMT4的活性  54-57
    4.2.3 aKMT4对两种RNA外切酶复合体作用方式不同  57-58
    4.2.4 aKMT4与底物相互作用很微弱  58-59
    4.2.5 硫化叶菌中aKMT4含量丰富,且不随生长周期和温度变化  59-61
  4.3 小结  61-62
第五章 aKMT4以不同方式甲基化染色质蛋白Cren7和Su17d  62-68
  5.1 背景  62
  5.2 实验结果  62-67
    5.2.1 aKMT4对Cren7的甲基化修饰  62
    5.2.2 aKMT4对Sul7d的甲基化修饰  62-64
    5.2.3 DNA显著促进aKMT4对Su17d的甲基化,对Cren7的甲基化影响很小  64-67
  5.3 小结  67-68
第六章 aKMT4的自甲基化修饰抑制酶的活性  68-72
  6.1 背景  68
  6.2 实验结果  68-71
    6.2.1 aKMT4存在分子内的自甲基化修饰  68
    6.2.2 aKMT4的自甲基化修饰是一种稳定状态  68-69
    6.2.3 aKMT4的自甲基化修饰抑制酶对底物的活性  69-71
  6.3 小结  71-72
第七章 aKMT4能够甲基化解旋酶SisMCM  72-75
  7.1 背景  72
  7.2 实验结果  72-74
  7.3 小结  74-75
第八章讨论与展望  75-77
参考文献  77-86
致谢  86-87
个人简介  87-88
附录  88-91

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