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利用环介导等温扩增技术探究褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）肝CYP1A对海洋污染的响应

作　者: 莫正平
导　师: 陈荣
学　校: 厦门大学
专　业: 环境科学
关键词: 环介导等温扩增 CYP1A 褐菖鲉 重金属 石油水溶性成分
分类号: X174
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


细胞色素P450(Cytochrome P450)酶系的诱导已被认为是反映环境污染状况最灵敏的生物学反应之一,其中CYP1A (Cytochrome P4501A)对污染物响应敏感,可作为生物标志物反映水体受原油等有机污染物污染的情况。因此,建立一种快速简便的方法检测ICYP1A对环境监测具有重要意义。环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新型的核酸扩增技术,因具有灵敏度高、特异性强、简便、快速等优点目前已广泛应用于细菌、寄生虫、病毒等方面的定性检测。本研究建立并优化褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)肝CYPIA的LAMP技术,与real-time PCR技术进行比对,验证LAMP技术应用于CYPIA定量的可行性；利用LAMP定量技术测定石油水溶性成分(Water soluble fraction, WSF). Cd和Pb单独污染后褐菖鲉肝CYP1A mRNA表达量,分析褐菖鲉肝CYPIA基因对石油WSF及Cd、Pb单独污染的响应；用石油WSF和重金属对褐菖鲉进行复合污染实验,检测褐菖鲉肝CYP1A mRNA表达量,分析褐菖鲉肝CYP1A对WSF及Cd和Pb复合污染的响应。主要研究结果如下：(1)建立并优化了褐菖鲉肝CYP1A的LAMP检测技术,优化后的LAMP体系外引物与内引物浓度比为1：6,Mg2+浓度为6.0mmol·L-1,甜菜碱浓度为0.4mol·L-1, dNTP浓度为1.4mmol·L-1,在64℃反应50min。(2)分析两种方法测定的石油WSF污染后褐菖鲉肝脏CYPIA表达量,发现LAMP与real-time PCR检测结果有高度的一致性,证实了LAMP技术应用于海洋鱼类基因定量的可行性。(3)利用定量LAMP技术检测石油WSF. Cd和Pb单独污染后褐菖鲉肝CYP1A mRNA表达量,结果表明褐菖鲉肝CYP1A对石油WSF和Pb污染响应敏感,而对Cd污染没有明显的响应。石油WSF单独暴露后,褐菖鲉肝CYP1A表达量呈现先上升后下降的趋势。CYPIA mRNA表达量首先随着WSF浓度的升高而增加,在50μg·L-1时CYP1A mRNA表达量达到最大值,而后CYPIA mRNA表达量开始呈现下降趋势,但是仍然被显著诱导。Cd暴露后,褐菖鲉肝CYP1A表达量无明显变化,而Pb暴露后,CYP1A mRNA表达被显著诱导。(4)利用定量LAMP技术检测石油WSF和Cd、Pb复合污染后褐菖鲉肝CYP1A mRNA表达量。结果表明褐菖鲉肝CYP1A对Cd和WSF复合污染响应不够敏感；而褐菖鱼由肝CYP1A对Pb和WSF复合污染响应非常敏感,且Pb促进WSF对CYP1A mRNA的诱导。

全文目录


摘要  10-12
Abstract  12-14
第1章 绪论  14-30
  1.1 海洋污染概述  14-20
    1.1.1 海洋石油污染  14-17
    1.1.2 海洋重金属污染  17-20
  1.2 生物标志物  20-26
    1.2.1 生物标志物定义及分类  20-21
    1.2.2 生物标志物特点  21
    1.2.3 海洋污染监测中常见的生物标志物  21-26
  1.3 LAMP方法概述  26-28
  1.4 本研究的意义、目的及主要内容  28-30
    1.4.1 研究意义  28
    1.4.2 研究目的  28
    1.4.3 研究内容  28-30
第2章 LAMP技术检测CYP1A基因表达方法的建立  30-47
  2.1 材料  30-31
    2.1.1 实验动物  30
    2.1.2 主要试剂  30
    2.1.3 主要仪器  30-31
  2.2 实验方法  31-36
    2.2.1 验证实验  31
    2.2.2 实验样品准备  31-33
    2.2.3 real-time PCR及LAMP引物设计  33-34
    2.2.4 LAMP反应体系及条件的优化  34-35
    2.2.5 LAMP定量方法  35-36
    2.2.6 real-time PCR定量方法  36
    2.2.7 数据处理  36
  2.3 实验结果  36-44
    2.3.1 引物验证结果  36-37
    2.3.2 LAMP反应体系优化结果  37-41
    2.3.3 CYP1A的LAMP定量方法的建立  41-44
  2.4 讨论  44-47
    2.4.1 LAMP标准体系的优化  44-45
    2.4.2 LAMP定量方法的可行性及优势  45-47
第3章 原油WSF、Cd、Pb单独污染后褐菖鲉肝CYP1A基因的表达  47-55
  3.1 材料与方法  47
    3.1.1 实验动物  47
    3.1.2 主要试剂  47
    3.1.3 主要仪器  47
  3.2 实验方法  47-48
    3.2.1 污染实验  47-48
    3.2.2 实验样品准备  48
    3.2.3 LAMP技术定量检测CYP1A mRNA表达  48
    3.2.4 数据处理  48
  3.3 实验结果  48-51
    3.3.1 原油WSF单独暴露后褐菖鲉肝CYP1A基因表达变化  48-49
    3.3.2 Cd、Pb单独暴露后褐菖鲉肝CYP1A基因表达变化  49-51
  3.4 讨论  51-55
    3.4.1 原油WSF单独暴露对褐菖鲉肝CYP1A mRNA表达的影响  51-52
    3.4.2 Cd、Pb单独暴露对褐菖鲉肝CYP1A mRNA表达的影响  52-55
第4章 LAMP定量技术检测原油与Cd、Pb复合污染后褐菖鲉肝CYP1A基因的表达  55-67
  4.1 材料  55
    4.1.1 实验动物  55
    4.1.2 主要仪器  55
    4.1.3 主要试剂  55
  4.2 实验方法  55-57
    4.2.1 以SYBR Green Ⅰ为染料的LAMP方法的建立  55-56
    4.2.2 原油WSF和Cd、Pb复合污染实验  56-57
    4.2.3 LAMP技术定量检测CYP1A mRNA表达  57
    4.2.4 数据处理  57
  4.3 实验结果  57-62
    4.3.1 LAMP反应产物荧光测定相关因素的优化  57-58
    4.3.2 定量LAMP标准曲线  58
    4.3.3 WSF及Cd、Pb复合暴露后褐菖鲉肝CYP1A mRNA的表达变化  58-62
  4.4 讨论  62-67
第5章 结论与展望  67-70
  5.1 结论  67
  5.2 创新点  67-68
  5.3 展望  68-70
参考文献  70-82
发表文章及参加课题  82-83
致谢  83

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境动物学
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