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酵母ω-酰胺酶Nit2的酶学机制研究与酵母组蛋白伴侣Hif1的结构与功能探究

作　者: 刘合军
导　师: 牛立文
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 酵母Nit2蛋白质晶体结构 α-酮戊二酸 ω-酰胺酶组蛋白伴侣组蛋白乙酰化酶酵母Hif1TPR结构域核自身抗原精子蛋白染色质重装配
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

Nit蛋白质家族广泛分布于动物、植物、真菌和原核细胞中,是氰水解酶超家族的第十分支。哺乳动物具有两种Nit蛋白,分别为Nitl和Nit2,它们之间具有很高的序列同源性。酵母Nit2是哺乳动物肿瘤抑制因子Nitl的同源蛋白,与Nitl一样,其底物特异性均是未知。近期研究发现,哺乳动物推测的肿瘤抑制因子Nit2是可以特异性水解α-酮戊二酸单酰胺和α-酮基琥珀酰胺的ω-酰胺酶。目前,对哺乳动物Nit2的催化机制了解甚少,而且哺乳动物Nitl的自然底物也是未知的。为此,我们解析了酵母Nit2蛋白分别在其活性中心与α-酮戊二酸和草酰乙酸共价结合的复合体结构。结构分析表明,酵母Nit2通过其Arg173、 Thr196和Thr199这三个氨基酸残基识别并结合α-酮戊二酸和草酰乙酸的α-端官能团,并通过其高度保守的催化三联体CEK结合α-酮戊二酸和草酰乙酸的γ/β-端。另外,酵母Nit2高度保守的Phe195与配体α-端官能团存在一种新型的γ/β型阴离子-π分子识别作用。同时,通过酵母Nit2结构分析发现,其二聚化参与催化反应进程。酵母Nit2的β6/7-发夹可能通过二聚体界面的传递作用而参与这一催化反应进程。酵母Nit2中参与配体相互作用的残基在Nit家族蛋白中具有高度的序列保守性,这暗示了该机制可能为Nit蛋白通用的识别与催化机制。不过,我们发现酵母Nit2与哺乳动物Nit2在结合口袋处也有重要差异,这导致了其以α-酮戊二酸单酰胺作为底物时的ω-酰胺酶活性极低,类似于哺乳动物的Nitl的活性。通过分析酵母Nit2活性口袋的大小,推测其可能结合较大的底物分子。本研究中所解析的酵母Nit2C169S突变体与未知内源性配体结合的复合物结构表明,酵母Nit2的自然底物可能是α-酮戊二酸单酰胺-N-酰胺取代二肽或者类似大小的其他α-酮戊二酸单酰胺-N-酰胺取代衍生物。哺乳动物Nitl在口袋大小方面与酵母Nit2类似,它可能具有非常相似的底物结合特异性。本研究对于酵母Nit2酶活机制的研究加深了我们对哺乳动物Nit2蛋白质酶催化机制的了解,同时为探索哺乳动物Nit1的自然底物进而解释其生物学功能提供了线索。酵母Hif1最早是在核内的组蛋白B型乙酰化酶复合体中发现的。虽然它不参与乙酰化酶活性的调控,但参与B型乙酰化酶调节的端粒沉默并能促进核小体装配。现己发现,Hifl作为组蛋白的伴侣分子发挥其生物学功能。它与组蛋白伴侣Asfl在染色质重装配方面具有同等重要的作用,在复制偶联和非复制偶联的的染色质重装配过程中,可能同样起到招募组蛋白结合复合物结合到染色质上发挥相应功能的作用。此外,其人源同源蛋白核自身抗原精子蛋白(NASP)参与诸如细胞增殖等重要的生命调控活动。为此,我们解析了组蛋白伴侣分子Hifl的晶体结构。结构分析表明,Hifl是由一个TPR结构域和一个插入的酸性无规卷曲肽段组成。TPR结构域为Hifl提供基本的结构骨架,插入的肽段结合在TPR结构域上并可能改变TPR结构域的构象。我们发现,Hifl通过结合组蛋白H3/H4而结合核心组蛋白八聚体。在这个结合过程中,Hifl中的插入肽段起到重要的作用。另外,基于三维结构的蛋白质空间特征比对暗示,Hifl中TPR结构域的凹槽可能起到结合肽段的作用。分子对接计算表明,TPR结构域的凹槽可能起到结合组蛋白H3的尾巴的作用,而插入肽段可能起到识别组蛋白H4尾巴的修饰状态的作用。本研究解析的Hifl晶体结构目前是SHNi-TPR家族中第一个被解析的结构,这为了解SHNi-TPR家族蛋白质的基本特征提供重要的结构基础。同时,酵母Hifl晶体结构的解析,为今后深入研究核内组蛋白B型乙酰化酶及其与组蛋白的相互作用提供初步的结构分析模型。

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摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
第一篇酵母ω-酰胺酶Nit2的酶学机制研究  11-61
  第1章 Nit家族蛋白的发现和功能探索  11-19
    1.1.1 Nit蛋白家族  11
    1.1.2 Nit蛋白的生化功能分析  11-14
    1.1.3 Nit蛋白的生理功能  14-16
    1.1.4 Nit蛋白的基于结构的功能探索  16-19
  第2章实验结果与讨论  19-52
    1.2.1 酵母Nit2蛋白样品的准备和蛋白晶体制备  19-20
    1.2.2 衍射数据收集和指标化等数据处理  20-22
    1.2.3 结构解析和模型修正  22-24
    1.2.4 晶体结构模型的质量分析  24-33
    1.2.5 拓扑结构分析  33
    1.2.6 酵母Nit2的晶体结构  33-36
    1.2.7 酵母Nit2与同源蛋白质的结构比较  36-37
    1.2.8 酵母Nit2的催化活性中心  37-41
    1.2.9 二聚体作用界面对活性中心的影响  41-43
    1.2.10 ω-酰胺酶活性分析  43-44
    1.2.11 Nit蛋白在底物识别模式上的异同  44-47
    1.2.12 酵母Nit2自然底物的初步探索  47-50
    1.2.13 远期展望  50-52
  本篇小结  52-53
  第3章实验材料设备与方法  53-56
    1.3.1 本研究中相关表达质粒的构建  53-54
    1.3.2 本研究中相关蛋白的表达和纯化  54
    1.3.3 α-酮戊二酸单酰胺的制备  54-55
    1.3.4 酶活性的实验测定  55-56
  参考文献  56-61
第二篇酵母组蛋白伴侣Hif1的结构与功能探究  61-111
  第1章组蛋白乙酰化修饰与染色质装配  61-73
    2.1.1 染色质的状态  61-63
    2.1.2 组蛋白乙酰化酶  63-65
    2.1.3 HAT-B复合体参与端粒沉默和染色质重装配  65-68
    2.1.4 Hif1的功能研究进展  68-73
  第2章实验结果与讨论  73-95
    2.2.1 蛋白质样品准备和晶体制备  73-75
    2.2.2 衍射数据收集和处理  75-77
    2.2.3 结构解析和模型修正  77-80
    2.2.4 Hif1晶体结构模型质量分析  80-83
    2.2.5 Hif1的拓扑结构  83-85
    2.2.6 Hif1晶体结构的三维特征  85-88
    2.2.7 Hif1的结构比对  88
    2.2.8 Hif1与组蛋白的结合分析  88-92
    2.2.9 Hif1与组蛋白结合的模型推测  92
    2.2.10 Hif1研究框架与展望  92-95
  本篇小结  95-97
  第3章实验材料、设备与方法  97-100
    2.3.1 酿酒酵母Hif1及其相关改造蛋白的重组表达质粒的构建  97-98
    2.3.2 重组蛋白的表达  98-99
    2.3.3 GST-pulldown实验  99
    2.3.4 重组酵母组蛋白复合物的制备  99-100
  参考文献  100-111
致谢  111-113
在读期间(待)发表的学术论文和取得的其他科研成果  113

酵母ω-酰胺酶Nit2的酶学机制研究与酵母组蛋白伴侣Hif1的结构与功能探究

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