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REGγ调控脂质代谢的研究

作　者: 贾彩凤
导　师: 李晓涛
学　校: 华东师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: REGγ 脂质代谢 脂肪肝 自嗜
分类号: Q493
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


REGγ是一种20S蛋白酶体激活因子,促进了真核生物体内蛋白质的非泛素化非ATP依赖的蛋白质降解过程,在细胞周期调控以及人类的多种疾病发生发展中发挥重要的作用。脂质代谢异常会导致很多疾病如脂肪肝、肥胖等代谢综合征的发生,而关于REGγ与脂类质代谢方面的研究目前还鲜有报道。本文模拟人类非酒精性脂肪肝的发生过程,采用高脂喂养REGγ基因敲除小鼠,同时结合细胞实验,研究了REGγ调控脂肪肝发生的关系。结果表明：REGγ基因缺失能保护高脂食物诱导的小鼠脂肪肝的发生；在原代小鼠肝脏细胞中,证明了REGγ基因缺失可以抑制有机酸诱导的肝细胞中脂质的积累。基因表达分析结果表明：在野生型小鼠和REGγ基因缺失小鼠肝脏组织中,脂质积累相关的重要酶和转录因子mRNA水平没有显著性差异。肝脏组织的透射电镜结果表明：REGγ基因缺失小鼠中自嗜体的数量明显上调；高脂喂养后REGγ基因缺失小鼠中脂滴的大小和数量显著性下调；进一步观察发现有自嗜体和脂滴相伴甚至自嗜体包裹脂滴的现象存在。细胞水平上,采用放射性同位素标记的底物检测了原代小鼠肝脏细胞中脂质生成、脂肪酸摄取以及脂肪酸β氧化水平,结果表明REGγ基因缺失细胞中脂肪酸p氧化水平明显上调,而脂质的生成和脂肪酸的摄取则没有显著性差异。这些研究结果促使我们猜想REGγ是通过影响自嗜进一步调控肝脏脂质代谢的。接下来我们对猜想进行了验证,肝脏组织及多种细胞水平上,WB实验结果表明REGγ基因缺失能够上调自嗜活性。细胞水平的免疫荧光实验表明REGγ基因缺失上调了自嗜marker LC3的细胞质中点状分布。用自嗜抑制剂3MA处理细胞则会逆转REGγ对脂质代谢的影响；自嗜抑制剂氯喹腹腔注射高脂喂养的小鼠,结果表明REGγ基因缺失对脂肪肝的保护作用也有了一定程度的消减。这些结果验证了我们的推测即：REGγ通过抑制自嗜从而调控了肝脏脂质的生成。另外本文就REGγ对老化小鼠脂肪组织的生脂以及胰岛素敏感性方面也进行了初步的研究。本文揭示了REGγ与脂质代谢的关系,为脂肪肝、肥胖等代谢综合征的研究提供一定的理论基础,有望为人类脂肪肝等代谢疾病的治疗提供新的药物靶点,因此本课题的研究具有相当的创新性和重要的临床应用价值。

全文目录


论文摘要  6-8
ABSTRACT  8-15
第一章 文献综述  15-46
  第一节 蛋白酶体降解系统  15-21
    1.1 泛素依赖的蛋白酶体降解系统  15-18
      1.1.1 泛素及与泛素相关的重要酶  16-17
      1.1.2 蛋白酶体  17-18
    1.2 非泛素依赖的蛋白酶体系统  18-21
      1.2.1 20S蛋白酶体  20-21
      1.2.2 与20s蛋白酶体结合的调节因子  21
  第二节 REGγ的研究进展  21-28
    2.1 REGγ的分子结构和生化特征  21-23
    2.2 REGγ的生物学功能  23-24
    2.3 REGγ与疾病的相互关系  24-28
      2.3.1 癌症  25-26
      2.3.2 神经退行性疾病  26-27
      2.3.3 病毒性疾病  27
      2.3.4 心脏疾病  27-28
      2.3.5 老化  28
  第三节 自嗜的研究进展  28-37
    3.1 自噬的诱导和调控  29-30
    3.2 自噬体的形成过程  30-31
    3.3 自噬的分类  31
    3.4 自噬的检测方法  31-35
      3.4.1 透射电子显微镜(TEM)  31
      3.4.2 自噬体标记蛋白LC3的检测  31-35
      3.4.3 自噬降解底物p62蛋白的免疫印迹检测  35
    3.5 自噬过程—自噬流的检测  35-37
      3.5.1 LC3的Turnover分析  35
      3.5.2 长寿命蛋白降解  35-37
      3.5.3 LC3和其他自噬性底物的降解  37
  第四节 脂质代谢与自噬关系  37-45
    4.1 脂质代谢异常  38-42
      4.1.1 脂肪肝的发生发展  38-40
      4.1.2 脂肪组织脂质代谢展  40-42
    4.2 自噬与脂质代谢中的调控作用  42-45
      4.2.1 自噬对肝脏脂滴的降解  42-44
      4.2.2 自噬在脂肪组织中的作用  44-45
  第五节 本研究的目的和意义  45-46
    5.1 研究目的  45
    5.2 研究意义  45-46
第二章 实验材料和方法  46-66
  第一节：实验材料  46-51
    1.1 小鼠及细胞  46
    1.2 常用分子生化试剂及试剂盒  46-47
    1.3 本论文所涉及抗体、耗材及手术器材  47-48
    1.4 本论文所涉及引物序列及合成  48-50
    1.5 本实验所用到的仪器  50-51
    1.6 本论文所配制溶液  51
  第二节：实验方法  51-66
    2.1 小鼠实验  51-54
      2.1.1 小鼠的繁育  51-52
      2.1.2 摄食量的测定  52
      2.1.3 小鼠的葡萄糖耐受实验(IPGTT)  52
      2.1.4 小鼠的胰岛素耐受实验(ITT)  52-53
      2.1.5 小鼠血糖和血脂的测定  53
      2.1.6 肝脏总TG的测定  53-54
    2.2 细胞实验  54-56
      2.2.1 小鼠原代肝脏细胞的制备  54
      2.2.2 有机酸诱导原代肝脏细胞脂质的积累  54
      2.2.3 肝细胞脂质合成的检测  54-55
      2.2.4 脂肪酸摄入实验  55
      2.2.5 脂肪酸氧化实验  55
      2.2.6 原代成纤维细胞的制备  55-56
    2.3 分子操作实验  56-62
      2.3.1 蛋白质免疫印迹检测  56-57
      2.3.2 细胞免疫荧光检测  57-58
      2.3.3 小鼠基因型鉴定  58-60
      2.3.4 RNA提取及Q-PCR  60-61
      2.3.5 半定量PCR分析  61-62
      2.3.6 MEF细胞诱导成脂实验  62
    2.4. 病理学实验  62-66
      2.4.1 组织的HE染色  62-64
      2.4.2 组织的油红染色  64-65
      2.4.3 细胞中脂滴的荧光染色  65
      2.4.4 肝脏组织切片的透射电镜观察  65-66
第三章 实验结果和分析  66-94
  第一节：REGγ对高脂喂养小鼠脂肪肝的保护作用  66-74
    1.1 REGγ对高脂喂养的小鼠体重的影响  66-67
    1.2 REGγ对高脂喂养的摄食量的影响  67
    1.3 REGγ对高脂喂养小鼠肝脏的影响  67-69
    1.4 REGγ对原代小鼠肝脏细胞诱导成脂的影响  69-70
    1.5 REGγ对高脂喂养小鼠肝脏脂质代谢基因表达半定量分析  70-71
    1.6 REGγ对高脂喂养小鼠肝脏脂质代谢基因表达的QPCR分析  71
    1.7 REGγ对高脂喂养小鼠肝脏切片的电镜观察  71-73
    1.8 REGγ基因缺失对小鼠原代肝脏细胞脂质代谢的检测  73-74
    1.9 小结  74
  第二节 REGγ抑制肝脏自噬作用影响肝脏脂质生成  74-82
    2.1 REGγ基因缺失增强细胞自噬作用  74-75
    2.2 REGγ基因缺失上调小鼠自噬作用的发生  75-76
    2.3 REGγ对LC3核质分布的影响  76-78
    2.4 自噬的抑制增强REGγ基因缺失HepG2细胞脂肪的生成  78-79
    2.5 抑制自噬增强REGγ基因缺失原代肝脏细胞脂肪的生成  79-80
    2.6 抑制自噬增强REGγ基因缺失小鼠肝脏组织脂质的生成  80-81
    2.7 自噬抑制剂对HFD喂养小鼠肝脏组织自噬的影响  81
    2.8 小结  81-82
  第三节 REGγ基因缺失促进小鼠脂肪的生成  82-89
    3.1 REGγ基因缺失对脂肪组织的影响  82-83
    3.2 REGγ对各脂肪组织重量的影响  83-84
    3.3 REGγ基因缺失对脂肪细胞大小的影响  84
    3.4 REGγ基因缺失对脂肪组织基因表达的影响  84-85
    3.5 REGγ基因缺失对脂肪组织基因表达的QPCR分析  85-86
    3.6 REGγ对正常喂养小鼠脂肪组织自噬影响  86
    3.7 REGγ对HFD小鼠脂肪组织自噬影响  86-87
    3.8 REGγ对原代MEF细胞诱导成脂的影响  87-88
    3.9. 小结  88-89
  第四节 REGγ对小鼠胰岛素敏感性的初步研究  89-94
    4.1 REGγ对正常喂养小鼠葡萄糖耐量(IPGTT)的影响  89-90
    4.2 REGγ对正常喂养小鼠胰岛素耐量(ITT)的影响  90
    4.3 REGγ对小鼠血清胰岛素含量的影响  90-91
    4.4 REGγ对老化小鼠胰岛素耐量(ITT)的影响  91-92
    4.5 REGγ对老化小鼠脂肪组织的影响  92
    4.6 REGγ对老化小鼠脂肪细胞的影响  92-93
    4.7. 小结  93-94
第四章 全文总结  94-97
  第一节 主要研究结论  94-96
    1.1. REGγ对肝脏脂质代谢的影响  94
    1.2. REGγ基因缺失增强自噬的活性  94-95
    1.3. REGγ对脂肪组织的影响  95
    1.4. REGγ对小鼠胰岛素敏感性的初步研究  95-96
  第二节 主要创新点  96
  第三节 下一步工作  96-97
附录  97-102
参考文献  102-117
后记  117-118

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中图分类: > 生物科学 > 生理学 > 新陈代谢与营养
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