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朱鹮（Nipponia nippon）分子遗传多样性研究

作　者: 和雪莲
导　师: 丁长青
学　校: 北京林业大学
专　业: 野生动植物保护与利用
关键词: 朱鹮保护遗传学性别鉴定线粒体异质性群体遗传结构主要组织相容性复合体
分类号: Q953
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

朱鹦(Nipponia nippon)是世界上最濒危的鸟类之一。自1981年在陕西省洋县重新发现朱鹦野生种群以来,就地保护和易地保护方面取得显著成就,再引入工作亦逐步开展。本文针对朱鹮保护工作中急需解决的分子遗传学问题开展研究,包括朱鹮分子性别鉴定、线粒体DNA异质性、微卫星DNA群体遗传多样性和MHC Ⅱ类B基因多样性分析。主要结果和结论如下：1.首次利用引物2550F/2718R进行朱鹮性别鉴定,并根据2550F/2718R扩增产物的测序结果设计新引物对2467F/2530R；测序结果证明该引物对扩增位于Z和W染色体上同源染色体螺旋蛋白基因基因(Chromodomain-helicase-DNA binding protein gene,CHD1)第16内含子相关序列；产物在雌鸟为2条,在雄鸟仅为1条产物,由于雌鸟2条产物片段长度差异为达到194bp,扩增产物在1.8%琼脂糖凝胶上可以直接判定性别,达到了快速准确利用PCR方法鉴定朱鹮性别的目的。2.采用PCR产物直接测序和扩增片段基因型分型方法,对一共61个来自人工种群、野生种群和标本的朱鹃样品进行线粒体控制区结构变异和长度异质性研究,发现朱鹮线粒体DNA的D-loop区3’端具有一段11个碱基的重复区域；该区域在不同个体内有多种不同重复片段,其在个体间的重复次数不同呈现高度的长度异质性；异质性在亲代和子代、以及子代之间遵循瓶颈遗传。3.利用磁珠富集法筛选新的朱鹮微卫星位点,共随机挑取118个阳性克隆测序,得到可用于设计引物含有微卫星重复的32条序列并设计扩增引物,仅有12对引物扩增得到单一明亮条带,最终筛选得到3个新的多态微卫星位点；选择24个朱鹮已有微卫星位点和10个近缘物种美洲红鹮的微卫星位点筛选适用于朱鹦遗传多样性研究的多态微卫星位点,共得到有效多态位点11个,包括SNP位点1个。4.利用筛选得到的共14(3+11)个位点对来自9个群体共计261只朱鹮的样本进行种群遗传多样性分析,结果显示14个位点共有31个等位基因。陕西洋县的人工种群和野生种群被分为两大类,野生种群遗传多样性高于人工饲养种群。5.朱鹮群体以及个体遗传结构分析证明,所有遗传背景在9个群体中共享；已知谱系的33只人工种群在3个家庭间存在明显的遗传结构差异。人工群体同胞间遗传结构相似,而在2011年和2012年野生群体中则有58%和57%的巢内个体间遗传结构存在明显变异：建议在人工种群繁殖配对选择时应该考虑配对个体的遗传背景,最大限度保存物种的遗传多样性。6.首次利用PCR方法证明了朱鹮主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)Ⅱ类B基因具有双拷贝现象；对70个人工种群个体和145个生种群个体在2个拷贝基因的第二外显子(exon2)进行了多态性研究,发现2个位点在分别具有2个和4个等位基因,并且6个等位基因在两个种群共享；同时发现野生种群2个拷贝等位基因多样性和杂合度均低于人工种群。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-13
英文缩略表  13-14
1 引言  14-31
  1.1 朱鹮研究  14-18
    1.1.1 生物学习性  14
    1.1.2 朱鹮的历史  14-15
    1.1.3 朱鹮种群发展  15-17
    1.1.4 朱鹮的研究概况  17-18
  1.2 鸟类性别鉴定  18-21
    1.2.1 传统性别鉴定方法  18-19
      1.2.1.1 泄殖腔性别鉴定  18
      1.2.1.2 腹腔镜检法  18-19
      1.2.1.3 类固醇法  19
      1.2.1.4 核型分析法  19
    1.2.2 性别鉴定的分子生物学方法  19-21
      1.2.2.1 随机扩增多态DNA  19-20
      1.2.2.2 微卫星  20
      1.2.2.3 小卫星  20
      1.2.2.4 扩增片段长度多态性  20
      1.2.2.5 CHD1基因  20-21
  1.3 鸟类线粒体DNA及异质性  21-23
    1.3.1 线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)的结构  21-23
    1.3.2 线粒体异质性  23
  1.4 微卫星DNA标记  23-28
    1.4.1 微卫星简介  23-24
    1.4.2 微卫星的形成  24-25
    1.4.3 微卫星DNA分子标记的特点  25
    1.4.4 微卫星标记的获得  25-27
      1.4.4.1 跨物种扩增法(cross-species amplification)  26
      1.4.4.2 建立微卫星文库筛选微卫星位点  26-27
    1.4.5 微卫星的应用  27-28
  1.5 主要组织相容性复合体(MHC)  28-29
    1.5.1 鸟类MHC分子的结构特点  28-29
    1.5.2 MHC在保护生物学中的应用  29
  1.6 本研究的目的、意义及拟解决的问题  29-31
2 基于CHD1基因的朱鹮性别鉴定  31-48
  2.1 实验材料  31-32
  2.2 主要仪器及试剂配制  32-34
    2.2.1 主要仪器  32-33
    2.2.2 主要试剂配制  33-34
  2.3 基因组DNA提取及检测  34-35
  2.4 CHD1片段扩增  35-36
  2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳  36
    2.5.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳  36
    2.5.2 银染  36
  2.6 PCR产物克隆  36-38
    2.6.1 PCR产物的纯化回收  36-37
    2.6.2 PCR产物克隆  37-38
  2.7 测序及数据分析  38
  2.8 研究结果  38-44
    2.8.1 基因组DNA提取结果  38-39
    2.8.2 引物2550F/2718R用于朱鹮性别鉴定  39-40
    2.8.3 P2/P8用于朱鹮性别鉴定  40-41
    2.8.4 朱鹮CHD1相关序列  41-44
  2.9 讨论  44-48
    2.9.1 CHD1基因朱鹃性别鉴定  44
    2.9.2 鸟类性别鉴定引物  44-48
3 线粒体异质性研究  48-60
  3.1 实验材料  48-49
  3.2 主要仪器及试剂配制  49
  3.3 基因组DNA提取及检测  49-50
  3.4 线粒体DNA控制区扩增测序  50-51
  3.5 线粒体控制区异质性的基因型分型  51-52
    3.5.1 荧光引物设计及扩增  51
    3.5.2 基因分型  51-52
  3.6 数据分析  52
  3.7 研究结果  52-56
    3.7.1 线粒体DNA序列分析  52
    3.7.2 长度多态和异质性  52-55
    3.7.3 长度多态性和异质性的传递  55-56
  3.8 讨论  56-60
    3.8.1 朱鹮线粒体DNA控制区长度异质性检测  56-57
    3.8.2 朱鹮线粒体DNA控制区多态  57
    3.8.3 朱鹮线粒体DNA长度多态和异质性的起源  57-58
    3.8.4 线粒体DNA控制区多态性和异质性的传递  58-60
4 多态微卫星位点筛选及群体遗传多样性  60-103
  4.1 实验材料  60-61
  4.2 主要仪器及试剂配制  61
  4.3 基因组DNA提取及检测  61
  4.4 微卫星标记来源  61-63
    4.4.1 已有朱鹮微卫星位点  61-62
    4.4.2 近缘种微卫星位点  62-63
  4.5 磁珠富集文库法筛选朱鹮微卫星位点  63-66
    4.5.1 合成接头(Linker)  63-64
    4.5.2 基因组DNA酶切  64
    4.5.3 选择性扩增  64-65
    4.5.4 磁珠富集微卫星DNA片段  65
    4.5.5 PCR产物克隆测序,设计引物  65-66
  4.6 PCR-SSCP  66
  4.7 PCR产物测序,基因分型  66
  4.8 数据分析  66-71
    4.8.1 微卫星遗传多样性分析  67-68
    4.8.2 哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)  68-69
    4.8.3 连锁不平衡(Linkage disequilibrium,LD)  69-70
    4.8.4 瓶颈效应  70
    4.8.5 F统计量  70
    4.8.6 群体遗传结构  70-71
  4.9 研究结果  71-98
    4.9.1 磁珠富集文库法筛选位点  71-74
      4.9.1.1 基因pool  71
      4.9.1.2 预扩增  71-72
      4.9.1.3 富集片段扩增  72-73
      4.9.1.4 克隆测序  73
      4.9.1.5 新引物扩增  73-74
    4.9.2 多态性微卫星位点  74-76
    4.9.3 可用于朱鹮性别鉴定的微卫星位点  76-77
    4.9.4 微卫星多态性检测  77-82
    4.9.5 Hardy-Weinberg平衡检验  82-83
    4.9.6 累积亲权分配率  83
    4.9.7 瓶颈效应  83-86
    4.9.9 群体遗传距离及聚类分析  86-90
    4.9.10 群体遗传结构分析  90-97
    4.9.11 北京动物园饲养种群  97-98
  4.10 讨论  98-103
    4.10.1 微卫星位点筛选  98-99
    4.10.2 群体遗传多样性  99-100
    4.10.4 种群遗传分化  100-101
    4.10.5 人工种群繁殖管理  101-103
5 朱鹮MHC Ⅱ类B基因exon 2多态性  103-119
  5.1 实验材料  103
  5.2 主要仪器及试剂配制  103
  5.3 基因组DNA提取及检测  103
  5.4 PCR扩增引物设计,直接测序  103-104
  5.5 PCR-SSCP  104-105
  5.7 数据分析  105
  5.8 研究结果  105-112
    5.8.1 MHC Ⅱ类B基因双拷贝的分离  105-108
    5.8.2 MHC Ⅱ类B基因exon 2多态性  108-111
      5.8.2.1 PCR-SSCP  108-109
      5.8.2.2 BLB1/BLB2 exon 2新等位基因及遗传多样性分析  109-111
    5.8.3 MHC Ⅱ类B基因β结构域氨基酸序列  111-112
    5.8.4 MHC Ⅱ类B基因exon 2等位基因间的系统发生  112
  5.9 讨论  112-119
    5.9.1 朱鹮MHC Ⅱ类B基因双拷贝的首次发现  112-114
    5.9.2 MHC Ⅱ类B基因exon 2的进化  114-116
    5.9.3 MHC Ⅱ类B基因的多样性  116-119
6 结论  119-121
参考文献  121-139
个人简介  139-140
导师简介  140-141
成果清单  141-142
致谢  142-143

朱鹮（Nipponia nippon）分子遗传多样性研究

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