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用原子力显微镜研究细胞弹性变化对整合素与配体相互作用的影响

作　者: 吴贵生
导　师: 叶志义
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: 原子力显微镜细胞弹性受体/配体相互作用整合素α6β1
分类号: Q25
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

细胞力学研究细胞各个方面的性质，而细胞弹性是诸多力学性质中较重要的一个，细胞的结构和各种生理功能都与其生长的环境密切相关，而细胞所处的微环境的物理改变，不但会导致细胞的弹性发生变化，而且细胞表面表达的整合素水平及其在细胞外取向均可能发生变化，它们都会影响整合素与配体间的相互作用。以壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶作为可变基底材料，并将HepG2细胞接种到不同软硬度壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶基底上，培养48小时后对HepG2细胞的形态特征（如铺展面积、长轴/短轴比值）进行测量；用FITC-Phalloidin对细胞骨架进行染色观察；流式细胞仪对细胞表面表达整合素α6β1进行检测；原子力显微镜对不同软硬基底上生长的HepG2细胞的表面形貌、细胞弹性和细胞表面整合素与层粘连蛋白之间相互作用等进行研究。本研究获得的主要结果如下：（1）、壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶的硬度是可调节的，可以作为细胞力学研究的基底材料。（2）、在硬度越大的基底上，HepG2细胞的铺展面积和长轴/短轴比值越大。（3）、在不同软硬基底上HepG2细胞的表面形貌不同、细胞弹性也不同：在硬度约为1000pa的基底上细胞边缘伸出的触角较少，在对照组上则触角较多。对照组、3500pa和1000Pa水凝胶基底上HepG2细胞的杨氏模量分别为：2036±1045Pa、714±311Pa和803±445Pa。（4）、用不同物质修饰的探针对不同基底上生长的HepG2细胞进行粘附力检测，结果发现：功能化的探针与不同软硬基底上生长的细胞所产生的粘附情况不相同，对照组和实验组中，整合素α6β1与配体层粘连蛋白相互作用力的大小分别为19±7pN、37.5±15.8pN和38.85±19.7pN。（5）、进行细胞骨架染色时发现：对照组中HepG2的细胞骨架清晰且贯穿整个细胞，实验组中HepG2的细胞骨架不明显且分布在细胞边缘位置。（6）、在软硬度不同的基底上细胞表面整合素表达量出现变化：随硬度增加整合素α6β1表达下降(P<0.05)。本结论将为接下来更深层次的研究提供技术和方法指导；有助于对HepG2细胞力学性质和整合素与配体相互作用等相关研究，并最终可以为临床诊断提供帮助。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
英文缩写词表  7-8
1 绪论  8-13
  1.1 国内外研究现状  8-10
    1.1.1 用原子力显微镜研究生物分子间相互作用和细胞弹性的进展  9-10
  1.2 问题提出及实验设计  10-12
    1.2.1 问题的提出  10-11
    1.2.2 实验设计  11-12
  1.3 研究内容  12
  1.4 研究意义  12-13
2 壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶的制备及其性能研究  13-24
  2.1 实验材料与方法  13-14
    2.1.1 实验材料与仪器  13-14
  2.2 试剂制配方法  14-15
  2.3 实验方法  15-17
    2.3.1 壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶的制备  15
    2.3.2 壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶溶胀性测定  15
    2.3.3 壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶剪切模量的测量  15-16
    2.3.4 壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶毒性实验  16-17
  2.4 实验结果及分析  17-22
    2.4.1 壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶的制备分析  17-18
    2.4.2 壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶溶胀性分析  18
    2.4.3 壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶剪切模量的测量结果  18-21
    2.4.4 壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶毒性实验结果  21-22
  2.5 小结与讨论  22-24
3 不同软硬度壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶基底对 HepG2 细胞的影响  24-39
  3.1 实验材料与仪器  24-25
    3.1.1 材料与试剂  24-25
  3.2 实验方法  25-29
    3.2.1 不同软硬度壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶基底材料的制备  25
    3.2.2 HepG2 细胞在不同软硬度基底上生长的形态学观察  25-26
    3.2.3 原子力显微镜对不同基底上细胞形貌的观察  26
    3.2.4 不同软硬度壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶上细胞骨架染色  26-27
    3.2.5 利用 AFM 测量不同软硬度基底材料上细胞的杨氏模量  27-29
  3.3 实验结果及分析  29-35
    3.3.1 壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶杨氏模量测量结果  29
    3.3.2 细胞在不同硬度基底上的形态学观察  29-31
    3.3.3 原子力显微镜对不同基底上生长的细胞形态学观察  31-33
    3.3.4 不同软硬度壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶上细胞肌动蛋白骨架染色  33-34
    3.3.5 不同软硬度基底上 HepG2 细胞弹性模量测量结果  34-35
  3.4 小结与讨论  35-39
4 AFM 研究 HepG2 细胞表面整合素与配体相互作用情况  39-49
  4.1 实验材料与仪器  39
  4.2 实验方法  39-43
    4.2.1 流式细胞仪对 Integrinα6 和 Integrinβ1 表达的测定  39-40
    4.2.2 原子显微镜对层粘连蛋白与整合素相互作用的测量  40-43
  4.3 实验结果及分析  43-47
    4.3.1 流式细胞仪检测结果  43-44
    4.3.2 整合素与配体相互作用力测量结果  44-47
  4.4 小结与讨论  47-49
5 结论及展望  49-51
  5.1 主要研究工作与结论  49
  5.2 后续研究工作及展望  49-51
致谢  51-52
参考文献  52-57
附录  57
  A 作者在攻读硕士学位期间发表论文情况  57
  B 作者在攻读硕士学位期间参加科研项目情况  57

用原子力显微镜研究细胞弹性变化对整合素与配体相互作用的影响

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