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NK细胞活化性受体CD226的表达与功能研究

作　者: 侯胜科
导　师: 孙汭
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 细胞生物学
关键词: CD226 重组表达可溶性蛋白 NK细胞活化 NK细胞免疫突触
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

天然免疫系统在皮肤之内作为机体防御外来病原体入侵的第二道屏障,发挥着非常重要的作用。众所周知,NK在机体的天然免疫系统中发挥着重要的作用,杀伤肿瘤细胞、杀伤病毒感染的细胞、杀伤胞内寄生菌和杀伤真菌。NK细胞发挥这些作用主要是依靠其表面各种活化性受体和抑制性受体来实现的。目前已知的NK细胞活化性受体包括NKG2D、NKp30、NKp44和CD226等等。它们主要介导NK细胞对靶细胞的细胞毒作用,介导NK细胞对靶细胞的杀伤作用以及促使NK细胞各种细胞因子的分泌。NK细胞的抑制性受体包括CD94/NKG2A, KIR-L和TIGIT等等,主要发挥抑制NK细胞对组织自身的细胞的杀伤作用。本文主要探索活化性受体CD226分子的结构功能以及其与相应配体的识别机制。CD226在NK细胞上的功能主要包括介导NK细胞与靶细胞的粘附,NK细胞的活化以及NK细胞对靶细胞的细胞毒作用等等。CD226分子促使LFA-1的聚集并参与免疫突触的形成。CD226分子是Ⅰ型跨膜蛋白,属于免疫球蛋白受体超家族成员。在它的胞外N端有两个免疫球蛋白样结构域。CD226分子目前已知的配体有CD112分子和CD155分子,均为Ⅰ型跨膜蛋白。前者属于Nectii家族,后者是脊髓灰质炎病毒受体(PVR)。两种分子均为粘附分子。但是目前CD226分子和它的两种配体分子的相互作用机制尚不明确。本研究中我们构建了包含有CD226分子两个胞外结构域的CD226ECD片段和只包含有N端第一个结构域的CD226ECD1片段的原核表达载体。通过镍柱纯化之后制备出了带有6His标签的重组蛋白。并对蛋白功能进行了鉴定。主要获得的结果有以下几部分：1.CD226ECD和CD226ECD1片段的表达纯化我们用生物信息学方法预测了CD226分子的结构,之后根据二级结构预测的结果截取了相应的只包含胞外第一个结构域的ECD1片段和包含胞外两个结构域的ECD片段。在原核细胞中和6His标签融合表达之后发现是以包涵体形式存在的,我们对包涵体进行了变复性和镍柱纯化后得到了纯度在95%以上的可溶性蛋白。这些蛋白经过Western Blot鉴定和质谱鉴定之后确证为我们所需要的目的蛋白。2. CD226ECD1片段和CD226ECD片段的功能鉴定为了更进一步确认表达出来的蛋白是否具有生物学活性。我们首先检测了CD226ECD1和CD226ECD片段和CD226配体阳性的Hela、K562等细胞系的结合作用。并且采用CD226配体阴性的CHO-K1细胞系作为阴性对照,发现两种蛋白片段都可以和细胞结合。而且这种结合作用是可以被CD226的阻断性抗体阻断的。SPR试验同样表明两种蛋白片段都可以和CD155蛋白分子相互作用。之后,我们为了更加确认这种结合作用的生物学功能,检测了两种蛋白对NK-92杀伤靶细胞的影响。通过4小时51Cr杀伤试验,两种蛋白都可以阻断NK-92对靶细胞的杀伤作用。同时可以阻断NK细胞和靶细胞之间的结合以及NK细胞和靶细胞之间免疫突触和的形成。最后我们检测了NK细胞胞内信号分子,发现两种蛋白都可以抑制ERK通路传导活化性信号。综合上述结果,CD226分子通过其胞外第一个结构域识别其配体分子并发挥其生物学作用。3.可溶性CD226片段对于肿瘤细胞增殖的影响因为在之前的研究中发现正常人的血清中存在一定水平的可溶性CD226(sCD226),并且在癌症病人中高表达。为了探索这种可溶性蛋白的功能,我们构建了在N端带有6His和MBP标签包含全部CD226胞外248个氨基酸残基的原核表达载体。经过原核表达后得到可溶性的融合蛋白,然后用TEV酶将6His和MBP标签切掉之后用镍柱和分子筛对蛋白进行纯化,我们最终拿到了纯度在95%以上的不带任何标签的CD226胞外段全长可溶性蛋白。用这种蛋白来模拟血清中的可溶性蛋白来研究它对肿瘤细胞的影响。在和肿瘤细胞共孵育72小时之后我们对肿瘤细胞进行计数,发现可溶性CD226分子可以抑制Hela、K562这两种CD226配体阳性的肿瘤细胞系的增殖。并且随着可溶性蛋白剂量的增大,细胞数目也越少。为了进一步检测细胞数目减少的机制。我们检测了肿瘤细胞的细胞周期以及凋亡情况,发现细胞并没有产生凋亡,但是细胞周期被延长了。于是我们通过对肿瘤细胞胞内信号的研究发现Racl/Cdc42的磷酸化水平增加,表示这个分子降解增加,可能会影响细胞迁移能力。Cyclin D1被磷酸的量增多,表示细胞处于GO期的比例增多。我们通过划痕试验证实了CD226可溶蛋白可以抑制Hela细胞的迁移。综上所述：CD226分子通过其胞外第一个结构域参与配体识别、活化信号传导和免疫突触的形成。在正常人的体内,CD226分子可能会从细胞表面脱落形成可溶性分子,这种分子在癌症病人体内水平增高,可能有助于抑制肿瘤细胞的增殖和迁移,可能是机体的一种防御性机制。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
目录  10-13
表序  13-14
图序  14-16
符号说明  16-17
第一章综述：CD226在NK细胞中的功能  17-35
  1.1 前言  17-18
  1.2 CD226分子的结构和功能  18-28
    1.2.1 CD226分子结构特点  19-21
    1.2.2 CD226分子的配体  21-23
    1.2.3 与CD226分子相关的分子  23-25
    1.2.4 CD226分子介导NK细胞的生物学功能  25-28
  1.3 表面受体对NK细胞功能的影响  28-35
    1.3.1 表面受体介导NK细胞的识别  28-29
    1.3.2 表面受体介导NK细胞免疫突触的形成  29-31
    1.3.3 NK细胞的信号传导  31-35
第二章引言  35-39
  2.1 重组表达和纯化CD226胞外结构域蛋白片段  35-36
  2.2 CD226分子介导NK细胞的功能  36
  2.3 NECTIN家族信号传导和细胞周期  36-37
  2.4 重组表达和纯化可溶性CD226胞外蛋白片段  37-38
  2.5 可溶性CD226蛋白对于肿瘤细胞的影响  38-39
第三章实验材料与方法  39-63
  3.1 实验材料  39-45
    3.1.1 实验材料  39-42
    3.1.2 试剂配制  42-44
    3.1.3 实验仪器  44-45
  3.2 实验方法  45-63
    3.2.1 CD226 cDNA的克隆  45-48
    3.2.2 原核表达的载体构建  48-49
    3.2.3 原核重组蛋白表达  49-50
    3.2.4 包涵体制备、变复性和蛋白纯化定量  50-51
    3.2.5 蛋白鉴定  51-53
    3.2.6 细胞培养技术  53-54
    3.2.7 流式细胞技术  54-55
    3.2.8 SPR技术检测蛋白与蛋白相互作用  55-56
    3.2.9 ~(51)Cr释放法测定NK的杀伤  56
    3.2.10 免疫荧光检测免疫突触  56-57
    3.2.11 效应细胞和靶细胞细胞结合的检测  57-58
    3.2.12 数据分析  58
    3.2.13 CD226胞外段全长基因克隆  58-59
    3.2.14 融合蛋白载体的构建  59
    3.2.15 融合蛋白表达纯化  59-61
    3.2.16 CFSE染色检测细胞分裂增殖  61
    3.2.17 细胞凋亡检测  61-62
    3.2.18 划痕试验检测细胞迁移  62-63
第四章实验结果  63-87
  4.1 CD226通过胞外第一个结构域发挥功能  63-76
    4.1.1 CD226分子基因克隆和片段截取  63-66
    4.1.2 CD226分子表达载体构建  66-67
    4.1.3 CD226分子两种蛋白片段原核表达纯化  67-69
    4.1.4 CD226-ECD1和CD226-ECD蛋白片段包涵体的变复性和纯化  69-71
    4.1.5 CD226两种蛋白片段的活性检测  71-73
    4.1.6 CD226蛋白通过胞外第一个结构域即可发挥其生物学功能  73-76
  4.2 可溶性CD226分子抑制肿瘤细胞增殖和迁移  76-87
    4.2.1 可溶性CD226蛋白的表达和纯化  76-80
    4.2.2 可溶性CD226蛋白抑制配体阳性肿瘤细胞系增殖  80-82
    4.2.3 可溶性CD226蛋白可以延迟细胞周期但不诱导细胞凋亡  82-83
    4.2.4 可溶性CD226蛋白可以诱导Cyclin D1和Rac1/Cdc42磷酸化  83-84
    4.2.5 可溶性CD226蛋白抑制Hela细胞迁移  84-87
第五章讨论  87-95
  5.1 CD226分子蛋白片段的表达  87-88
  5.2 CD226分子的活性鉴定  88-90
  5.3 CD226分子的胞内信号  90
  5.4 CD226分子的识别机制  90-91
  5.5 可溶性CD226分子的功能  91-95
参考文献  95-99
致谢  99-101
攻读博士学位期间的主要研究成果  101
  论文发表情况及专利成果  101
  会议论文  101

NK细胞活化性受体CD226的表达与功能研究

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