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携带hBMP-2的tet-on慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞及Hbmp-2的体外表达

作　者: 周明
导　师: 孙康
学　校: 青岛大学
专　业: 骨外科
关键词: 可诱导慢病毒人脐带间充质干细胞 hBMP-2 tet-on系统强力霉素
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：研究携带hBMP-2的tet-on慢病毒载体对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs)的转染及转染后hBMP-2在强力霉素诱导下的表达情况。方法：按照文献方法培养人脐带间充质干细胞,消化传代,转染前一天,选取3.4代生长状态良好的HUCMSCs按照融合度40%接种到六孔板中,第二天进行pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA、pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP2共转染,转染后8h更换培养液。待培养24h之后用嘌呤霉素和G418进行稳定筛选。提取DNA进行PCR检测,确定基因是否已成功转入。选取稳定筛选后的脐带间充质干细胞,分别在不同强力霉素诱导浓度相同诱导时间和不同诱导时间相同强力霉素诱导浓度情况下用ELISA测定hBMP-2的表达情况。。对转染前后的HUMSCs进行成骨诱导,用茜素红染色法观察矿化物结节形成情况。结果：携带hBMP-2的tet-on慢病毒载体可成功转染人脐带间充质干细胞,且HUCMSCs可以通过强力霉素的诱导可控性表达hBMP-2。在相同诱导时间情况下,强力霉素10μg/ml时诱导表达最强,而在相同诱导浓度下,hBMP-2的表达在诱导48h后达峰值。HUCMSCs成骨诱导培养2周后,茜素红染色示细胞浆中有大量红色的钙化基质沉积。结论：携带hBMP-2的tet-on慢病毒载体成功转染人脐带间充质干细胞,并初步研究了hBMP-2在体外强力霉素诱导下的表达情况。为进一步研究hBMP-2诱导HUCMSCs成骨分化治疗骨坏死模型奠定实验基础,并提供了一种新的实验思路。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-7
引言  7-8
第一章材料与主要试剂仪器  8-10
  1.1 材料  8
  1.2 试剂及耗材  8-9
  1.3 主要仪器设备  9
  1.4 常用试剂的配备  9-10
第二章实验方法  10-16
  2.1 脐带间充质干细胞的培养、传代、冻存及复苏  10-12
  2.2 慢病毒转染间充质干细胞及稳定筛选  12-14
  2.3 PCR鉴定稳定转染的人脐带间充质细胞  14-15
  2.4 ELISA法测定hBMP-2的诱导表达情况  15-16
  2.5 转染后的人脐带间充质干细胞的成骨诱导  16
  2.6 统计学方法  16
第三章结果  16-25
  3.1 人脐带间充质干细胞的形态观察及生物学特征  16-17
  3.2 人脐带间充质干细胞增值率的测定  17-18
  3.3 人脐带间充质干细胞转染eGFP慢病毒  18-19
  3.4 人脐带间充质干细胞的免疫表型鉴定  19-20
  3.5 目的基因hBMP-2的鉴定  20-21
  3.6 目的基因rtTA的鉴定  21-22
  3.7 ELISA测定hBMP-2的表达  22-24
  3.8 人脐带间充质干细胞的成骨诱导  24-25
第四章讨论  25-28
  4.1 脐带间充质干细胞的来源  25
  4.2 脐带间充质干细胞的分离  25
  4.3 脐带间充质干细胞的一般生物学特性  25-26
  4.4 骨形成蛋白BMP-2  26
  4.5 慢病毒载体  26
  4.6 本实验的待完善处及展望  26-28
结论  28-29
参考文献  29-32
综述  32-40
  综述参考文献  37-40
攻读学位期间发表的论文  40
硕士期间参加的研究项目  40
硕士期间所获奖项  40
硕士期间其它成果  40-41
致谢  41-42

携带hBMP-2的tet-on慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞及Hbmp-2的体外表达

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