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羊水来源干细胞的分离培养及其生物学特征的研究

作　者: 王艳
导　师: 于新艳
学　校: 泰山医学院
专　业: 妇产科学
关键词: 人羊水来源干细胞细胞培养多能性
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的研究羊水来源干细胞(amniotic fluid-drived stem cells,AFS)的确切来源。目前,鉴定羊水来源干细胞没有什么好方法,只是通过细胞表面干细胞因子的表达情况和生物学特性来确定其是否为AFS。本实验在分离培养干细胞的基础上,研究其生物学特性;通过细胞形态及细胞原位免疫组化来明确羊水干细胞的确切来源,为下一步的临床治疗提供实验基础和理论依据。研究方法在知情同意的情况下,通过B超引导下腹腔穿刺抽取人孕16-24周的羊水18-20ml,原位培养2周后,待其达到50%融合后,将一部分P1培养瓶中的细胞分为两部分,倒置显微镜下,将培养瓶一分为二,用进口刮刀将其分别刮下,倒入新的培养瓶中,进行传代,记为P21、P22。由于刮刀对细胞的损伤较大,故继续传代用胰酶消化的方法,一瓶用来倒置显微镜下观察各种细胞的形态,绘制生长曲线、构建类胚胎及分析染色体核型;另一瓶,通过细胞免疫组化研究OCT-4、CD117的表达情况;另一部分P1,倒置显微镜下观察其形态并通过细胞原位免疫组化来研究其表面分子的表达情况,检测各种标志物如波形蛋白Vimen、广谱角蛋白CK、CD44、CD29、CD34、CD45的表达情况。结果1、通过细胞的原位培养,根据倒置显微镜下细胞形态的不同,将羊水中的细胞分为四类,为小岛样细胞、E样细胞、羊水特异细胞及成纤维样细胞。2、多次传代后,细胞不再呈集落样生长,而呈重叠样生长,以梭形为主,排列紧密,相互间界限不清。形态比原代更均匀,生长旺盛。可以连续传10代,没有发现细胞老化现象。3、羊水细胞生长曲线呈S形,P10比P3、P5生长缓慢。生长曲线的特征为:接种后2天左右为潜伏适应期,大约从第3天起为对数生长期,第8天达到高峰期,之后就进入了平台期,说明其在体外具有很强的增殖能力。4、将P7羊水细胞倒置悬浮培养3天,显微镜下可见类胚体样结构。证明了其具有向三个胚层分化的潜能,有待进一步的研究。5、取每代羊水细胞做染色体核型分析,都为正常二倍体核型,说明了其具有稳定遗传的特性。6、取P10做细胞免疫组化,结果显示其表达OCT-4、CD117,提示羊水中含有干细胞。7、小岛样细胞表达CK、Vimen、CD44、OCT-4,不表达CD117、CD34、CD45;E样细胞表达CK、Vimen、CD44、Oct-4、CD117,不表达CD34、CD45;羊水特异细胞表CK、Vimen、CD44、OCT-4,不表达CD117、CD34、CD45;成纤维样细胞表达Vimen、CD44、Oct-4、CD117,不表达CD34、CD45。结论及意义1、本实验证明上皮样细胞和成纤维样细胞都为羊水干细胞的确切来源。2、本实验根据其形态的不同,将羊水细胞分为小岛样细胞、E样细胞、羊水特异细胞及成纤维样细胞。3、本实验证明羊水中含有表达CD44、Vimen的间充质干细胞、表达干细胞因子CD117的干细胞、表达OCT-4的多能干细胞。4、本实验证明了羊水来源的干细胞在体外具有很强的增殖能力、分化潜能及稳定遗传的特性。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
符号说明  9-10
前言  10-13
第一部分羊水细胞的培养及生物学特性的研究  13-29
  材料和方法  14-19
  结果  19-21
  讨论  21-29
第二部分羊水细胞的分类及其羊水干细胞的来源  29-39
  材料和方法  30-33
  结果  33-35
  讨论  35-39
结论  39-40
附图  40-45
参考文献  45-47
综述  47-56
  参考文献  53-56
致谢  56-57
攻读硕士学位期间发表的学术论文  57

羊水来源干细胞的分离培养及其生物学特征的研究

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