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犬尿氨酸途径在达托霉素生物合成中的功能研究

作　者: 王磊
导　师: 胡昌华; 廖国建
学　校: 西南大学
专　业: 药物分析学
关键词: 达托霉素 S.roseosporus 犬尿氨酸犬尿氨酸途径生物合成
分类号: R914
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

达托霉素是由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)产生的一种天然环脂肽类抗生素。2003年FDA批准其用于革兰氏阳性致病菌引起的并发性皮肤及皮肤结构感染,随后于2006年批准治疗由金黄色酿脓葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的菌血症和右侧心内膜炎。达托霉素通过破坏细菌细胞膜快速杀死病原菌,有效避免细菌对其产生耐药性以及与其它抗生素的交叉感染,逐渐成为治疗革兰氏阳性耐药菌引起的感染疾病首选用药。目前关于达托霉素的研究主要集中在两方面：第一,通过传统的菌种选育方法和发酵工艺优化大幅提高达托霉素的产量,这些研究为达托霉素的工业化生产提供重要基础；第二,通过Sroseosporus的组合生物学研究寻找疗效更优的达托霉素结构类似物,这些研究揭示了达托霉素母核上各氨基酸对其抑菌活性的影响,为寻找疗效更佳的达托霉素类似物提供方向。大量研究揭示达托霉素母核氨基酸对其抑菌活性有重要影响,这些氨基酸在S. roseosporus中的生物合成途径对达托霉素的生物合成有重要作用。犬尿氨酸是达托霉素的特征氨基酸,是其母核的重要组成部分。在已知抗生素中,犬尿氨酸仅发现于达托霉素类抗生素中,它对达托霉素的抑菌活性有非常重要的影响,但关于它在S. roseosporus中的生物合成途径尚未报道。在许多微生物中,犬尿氨酸是由色氨酸通过犬尿氨酸途径分解代谢生成,是此途径重要的中间产物。犬尿氨酸作为达托霉素生物合成的重要前体,对其生物合成具有重要作用。因此,研究犬尿氨酸在S. roseosporus中的生物合成途径有着非常重要的意义。我们推测Sroseosporus NRRL 11379 (v4)中可能存在犬尿氨酸途径,这条途径生成的犬尿氨酸可能为达托霉素生物合成提供前体。研究犬尿氨酸途径以及此途径对达托霉素生物合成的影响将为代谢工程手段改造菌株和寻找疗效更佳的达托霉素类似物提供重要理论依据。目的：本文旨在研究S. roseosporus NRRL 11379 (v4)中犬尿氨酸的生物合成途径和此途径关键基因对达托霉素生物合成的影响,为改造S. roseosporus菌株以及寻找疗效更佳的达托霉素类似物提供依据。方法：1.本研究首先尝试建立大肠杆菌介导的遗传转化系统,优化接合转移条件,如优化抗生素浓度、抗生素覆盖时间等。2.分析S. roseosporus NRRL 11379 (v4)基因组序列,通过生物信息学分析找出参与犬尿氨酸生物合成途径的关键基因。设计引物,分别克隆参与此途径的重要基因：色氨酸2,3-加氧酶(tdo)、犬尿氨酸甲酰胺酶(kynf)、犬尿氨酸酶(枷)和达托霉素生物合成基因簇上的dptJ。3.设计引物分别扩增tdo、dptJ和kyn基因两侧同源臂,用重叠PCR将两端同源臂与卡那霉素抗性基因连接。将目的片段与pKC1139载体构建tdo、dptJ和kyn基因敲除质粒,通过接合转移将导入S. roseosporus NRRL 11379 (v4)中,接着通过温敏实验筛选发生同源双交换的基因敲除株(DM),并进行PCR验证；扩增含有核糖体结合位点tdo、dptJ基因,与pSET152载体构建tdo、dptJ基因过表达载体。通过接合转移,筛选tdo、dptJ过表达株(OM)和遗传互补株(DMC),并进行验证。重组菌株培养后收集菌液,进行生物活性检测和定量。结果：1.成功建立大肠杆菌介导的遗传转化系统,可以得到目的接合子。受体菌孢子最佳热激条件为50℃热激10 min；抗生素最佳覆盖时间为16-18h；抗生素最佳覆盖浓度为安普霉素(Apr)10μg/ml和萘啶酮酸(NA)25μg/ml。2.从S. roseosporus NRRL 11379 (v4)基因组中克隆出犬尿氨酸途径的三个关键基因tdo (849bp),kynf(933 bp),kyn (1233 bp)以及达托霉素生物合成基因簇上的dptJ (738 bp)基因。生物信息学表明tdo编码色氨酸2,3-双加氧酶,kynf编码犬尿氨酸甲酰胺酶,kyn编码犬尿氨酸酶,这些基因序列和基因位置都较保守。另外,重组蛋白KYN以犬尿氨酸为底物生成邻氨基苯甲酸,进一步确定S. roseosporusNRRL 11379(v4)中含有犬尿氨酸途径。3.成功构建tdo、dptJ和kyn敲除载体和tdo、dptJ过表达载体。根据同源重组原理,温敏实验后获得阳性菌株。PCR验证结果显示相应基因敲除成功,获得敲除突变株tdo DM、dptJ DM、kyn DM,同源重组几率分别为4%、0.4%和11%。将犬尿氨酸途径第一步反应中的tdo基因敲除后,达托霉素的产量降低55%；将达托霉素生物合成簇dptJ敲除后产量降低58%；分别遗传回补后产量得到增加。将犬尿氨酸途径第三步反应中的kyn敲除后,产量增加33.75%。将tdo、dptJ过表达载体导入S. roseosporus NRRL 11379 (v4)基因组后,获得tdo OM和dptJOM,产量分别增加了7%和112%。结论：本文结果显示S. roseosporus NRRL 11379 (v4)中存在犬尿氨酸途径,此途径通过提供犬尿氨酸前体而影响达托霉素生物合成。

全文目录

摘要  6-9
Abstract  9-12
缩略语  12-14
第1章综述  14-26
  1.1 链霉菌概述  14-15
    1.1.1 链霉菌基本生长特征  14-15
    1.1.2 链霉菌的次级代谢产物  15
  1.2 环脂肽类抗生素—达托霉素  15-20
    1.2.1 达托霉素的发现  15-16
    1.2.2 达托霉素的理化性质  16
    1.2.3 达托霉素的抗菌机理  16-17
    1.2.4 达托霉素的临床研究与应用  17-18
    1.2.5 达托霉素的生物合成  18-20
  1.3 S.roseosporus产达托霉素研究现状  20-23
    1.3.1 提高达托霉素产量  20-21
    1.3.2 寻找达托霉素结构类型物  21-23
  1.4 犬尿氨酸途径  23-26
    1.4.1 犬尿氨酸途径概述  23-24
    1.4.2 犬尿氨酸途径产物的生物学功能  24-26
第2章前言  26-28
第3章实验材料与方法  28-44
  3.1 实验材料  28-33
    3.1.1 菌株和质粒  28-29
    3.1.2 培养基  29-30
    3.1.3 常用抗生素  30
    3.1.4 实验试剂  30
    3.1.5 主要仪器  30-31
    3.1.6 引物  31-33
  3.2 实验方法  33-44
    3.2.1 大肠杆菌的培养以及菌种保藏  33
    3.2.2 大肠杆菌质粒的常规提取  33
    3.2.3 大肠杆菌质粒的快速提取和鉴定  33-34
    3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  34-35
    3.2.5 DNA酶切反应  35
    3.2.6 质粒与DNA片段的连接反应  35
    3.2.7 S.roseosporus的培养及孢子悬液的制备  35-36
    3.2.8 接合转移  36
    3.2.9 S.roseosporus DNA的提取  36-37
    3.2.10 PCR  37-39
    3.2.11 S.roseosporus培养液的收集  39
    3.2.12 生物活性检测以及产物定量  39-40
    3.2.13 蛋白质体外诱导表达  40
    3.2.14 蛋白质纯化和浓缩  40-41
    3.2.15 蛋白质定量  41
    3.2.16 重组蛋白KYN的酶活检测  41
    3.2.17 SDS-PAGE凝胶电泳  41-42
    3.2.18 序列分析以及数据分析  42-44
第4章实验结果与分析  44-64
  4.1 S.roseosporus遗传转化系统的建立  44-46
    4.1.1 接合转移条件的优化  44
    4.1.2 遗传转化方法的建立  44-46
  4.2 S.roseosporus中犬尿氨酸途径基因的克隆和分析  46-51
    4.2.1 色氨酸2,3-加氧酶基因(tdo)的克隆和分析  46-47
    4.2.2 犬尿氨酸甲酰胺酶基因(kynf)的克隆和分析  47-48
    4.2.3 犬尿氨酸酶基因(kyn)的克隆和分析  48-49
    4.2.4 S.roseosporus中犬尿氨酸途径的确定  49-51
  4.3 载体构建以及重组菌株的筛选  51-60
    4.3.1 tdo敲除载体和tdo过表达载体的构建  51-52
    4.3.2 tdo敲除突变株和tdo过表达菌株的筛选  52-54
    4.3.3 tdo遗传回补株的获得  54
    4.3.4 重组蛋白KYN的体外表达与酶活检测  54-55
    4.3.5 kyn敲除载体的构建  55-56
    4.3.6 kyn敲除突变株的筛选  56-57
    4.3.7 dptJ敲除载体和dptJ过表达载体的构建  57-58
    4.3.8 dptJ敲除突变株和dptJ过表达菌株的筛选  58-59
    4.3.9 dptJ遗传互补株的获得  59-60
  4.4 犬尿氨酸途径对达托霉素生物合成的影响  60-61
    4.4.1 tdo基因敲除对达托霉素生物合成的影响  60
    4.4.2 tdo基因过表达对达托霉素生物合成的影响  60-61
    4.4.3 kyn基因敲除对达托霉素生物合成的影响  61
  4.5 dptJ基因敲除和过表达对达托霉素生物合成的影响  61-64
    4.5.1 dptJ基因敲除对达托霉素生物合成的影响  61-62
    4.5.2 dptJ基因过表达对达托霉素生物合成的影响  62-64
第5章讨论  64-68
  5.1 S.roseosporus中犬尿氨酸途径的确定  64
  5.2 犬尿氨酸途径对达托霉素生物合成的影响  64-68
第6章总结  68-70
  6.1 总结  68
  6.2 创新点  68
  6.3 展望  68-70
参考文献  70-76
硕士期间发表论文和奖励情况  76-78
致谢  78-79

犬尿氨酸途径在达托霉素生物合成中的功能研究

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