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研究背景与目的从福尔马林固定、石蜡包埋组织内提取DNA一直以来都是一项困扰着众多研究人员的难题。甲醛作为常用固定液福尔马林的一个重要成分,可以引起核酸大分子之间以及核酸与蛋白质之间的广泛交联,这一反应将会导致从组织内提取DNA十分困难。不仅如此,如果固定所用的固定液不是缓冲型中性福尔马林溶液,还将出现甲醛被氧化生成甲酸后,固定液的PH值大幅降低,有时甚至会出现PH小于1的情况。这种酸性的环境将会导致DNA链的断裂。这些作用都导致无法利用PCR扩增技术得到满意的DNA片段长度和含量,从而严重影响了分子生物学研究。尽管从福尔马林固定石蜡包埋组织提取DNA十分困难,但却不能忽视这些组织可能为基因遗传学等研究提供的信息。在世界各地的医院及病理研究所都储存着大量的固定组织,它们常是唯一的致病相关基因研究重要的研究对象。正是因为如此,越来越多的学者开始研究如何从固定组织提取高质量DNA,并有一系列的相关论文逐渐发表。不容乐观的是,虽然相关性文章在不断增多,但是这些文章所提及的方法,能够达提取到高质量DNA的并不多。首先,因为研究目的不同,对目的基因要求不同,很难用同一的标准来判定提取DNA的质量；其次,虽然有些方法可以保证提取出的DNA含量,但是因为这些组织内的DNA多由于固定的原因而降解成较小的DNA片段,尽管含量可观,无法保证片段长度,这种方法仍是难以推广的。其实,影响固定组织内DNA质量的因素有很多,大体可以分为：1.固定前因素,这就包括了组织的类型和大小,固定前它的腐败程度等等；2.固定因素,包括了选取何种固定液,固定液的PH值,温度以及固定时间的长短等；3.固定后因素,例如固定后储存时间的长短和储存温度的高低等。面对如此多的影响因素,想要找到一种理想的提取方法还需进一步研究,并结合考虑样材的情况。福尔马林固定石蜡包埋组织被要求做个体识别和亲子鉴定的需求有增多趋势。而且这些组织大部分都是肿瘤组织,恶性肿瘤十分常见,恶性肿瘤组织中普遍存在着基因编码区或非编码区的变异,这种变异同样可以发生在法医学检测常用的15个STR基因座中。因此,研究常见肿瘤组织STR变异性十分必要。短串联重复序列(STR)广泛存在于真核生物的基因组中,具有高度的多态性。因为其核心序列较小通常为2-6bp,重复次数通常为15-30次,所以其片段长度较小,PCR扩增结果稳定,加上STR基因座的高度多态性在基因传递过程中遵循孟德尔遗传规律,它的这些特点使得PCR-STR复合扩增检测技术成为法医学不可缺少的一项重要的技术手段。虽然,PCR-STR符合扩增技术在组织身源认定的案件中应用广泛,但是这样的检测技术是有其假设前提的,既同一个体的任何组织的STR基因型都是完全一致的。当遇到的检材是肿瘤组织的时候,这样的假设前提便不再存在。已有研究发现,在肿瘤组织的基因组中,不论是编码区还是非编码区都有可能发生变异,这种现象在STR基因座内同样可以观察到。在肿瘤组织内的这种变异表现为杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH)和微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI),这些改变都可能会对PCR-STR复合扩增检测造成影响,导致肿瘤组织与正常组织STR分型结果不一致。方法1.脱蜡方法1.1水浴加热脱蜡将组织样本放入1.5mlEP管中,向管内加入1000ulTES(10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,0.5%SDS, pH8.5)溶液,在接近石蜡熔点的温度(65℃)下水浴30min,然后以13000rpm离心1min,弃去液体；重复上述操作1次-2次,而后于室温下晾干备用。1.2微波加热脱蜡向装有组织切片的1.5mlEP管中加入200u1消化缓冲液(50mmol/LTris,1mmol/LEDTA,0.5%Tween-20, pH8.5),密封后,置于微波炉中加热1min(时间视石蜡多少而定,但不宜过长),而后以13000rpm离心3min,弃去液体；如此重复4次,而后于室温下晾干备用。1.3二甲苯脱蜡向装有组织切片的EP管中加入1000u1二甲苯溶液,密封后放入摇床慢速摇荡1h,而后取下以13000rpm离心3min,弃去液体,重复操作一次；弃去液体,向装有组织切片的EP管中加入1000ul无水乙醇,密封后放入摇床,慢速摇荡3min,而后13000rpm离心3min,弃去液体,重复操作一次,弃去液体后,打开EP管于室温下晾干备用。2DNA提取方法2.1Chelex-100法结合QIAquick(?)PCR Purification Kit纯化试剂盒法向脱蜡完成后的组织加入适量配置的Chelex-100溶液及蛋白酶K,56℃孵育6h、98℃变性8min,以13000rpm离心90s之后将上清液与试剂盒中的PBI溶液按1：5的体积比混匀,然后向层析柱中加入适量上述混合液,以13000rpm离心1min,弃掉下层液体,重复此操作直至混合液全部虑过。加入300ulPBI溶液离心洗涤1次,加入制备的PE洗涤液,离心洗涤2次,再以13000rpm离心1min,甩干残余液体后把层析柱放置于新的1.5ml离心管上,打开管盖室温挥发5min。将已在65℃预热的EB洗脱液30ul直接加入到层析柱的硅膜上,65℃孵育10min,然后再以13000rpm离心2min,收集下层液体用于PCR反应或保存备用。2.2磁珠提取法将脱蜡后的样品放在1.5mlEP管中,向管内加入100ul制备的裂解液,密闭EP管,将离心管95℃加热30min。然后从加热器上取下EP管,将裂解液和样品转移到离心套管中,以13000rpm室温离心2min,取下离心套管。涡旋振荡树脂储存瓶,使树脂悬浮,向DNA溶液中加入7ul树脂,加样时保持树脂完全悬浮。短暂震荡样品/裂解液/树脂混合物,于室温下保温5min。将EP管放在磁力架上,待磁珠与溶液分离后,仔细除去溶液,不要碰触管壁的树脂。加入100ul裂解液,从磁力架上取下EP管,短暂涡旋振荡使磁珠悬浮,将EP管放回磁力架上并去掉所有裂解液。加入100ul制备的洗涤液,从磁力架上取下EP管短暂涡旋振荡,然后将EP管放回磁力架上,并去掉所有洗涤液。洗涤液洗涤重复3次,并保证最后一次去除所有溶液。将磁力架上的EP管打开,空气中干燥5min。加入50ul洗脱液,密闭离心管,短暂涡旋振荡使树脂悬浮,于65℃水浴加热5min。从水浴池中取出EP管后短暂涡旋振荡,立即放到磁力架上。小心将溶液转移到指定管内,备用或储存。2.3chelex-100法结合DNAIQTM试剂盒磁珠纯化法向脱蜡完成后的组织加入适量配置的Chelex-100溶液及蛋白酶K,56℃孵育6h、98℃变性8min,然后纯化方法参考2.2。3.PCR复合扩增采用sinofiler扩增试剂盒(Applied Biosystems,美国),9700型扩增仪进行PCR扩增。4.3130XL遗传分析仪电泳检测sinofiler扩增试剂盒：向96孔电泳板(plate)的每个样品孔内,加入10ulHi-Di甲酰胺,0.3ulLIZ-500内标,1.0ulPCR扩增产物或者标准等位基因阶梯Ladder。加样后,将样品板水平离心,放入3130XL型遗传分析仪电泳,GeneMapper3.2.1软件分析。5.PCR定量采用QuantifilerTMHuman荧光定量PCR试剂盒,使用7500型实时荧光定量PCR仪进行PCR定量。结果1.三种石蜡包埋组织提取方法的比较三种不同提取方法得到的DNA含量差异有统计学意义(F=13.139,P<0.001)；其中Chelex-100提取结合层析柱纯化法提取DNA平均量显著高于磁珠提取、Chelex-100提取结合磁珠纯化法(2.139±3.820versus0.911±2.283, P=0.011;2.139±3.820versus0.709±2.003, P=0.003),而磁珠提取法与Chelex-100提取结合磁珠纯化法提取DNA平均含量无统计学差异。且三种提取方法与脱蜡方法间交互效应无统计学意义(F=2.266,P=0.069)。2.石蜡包埋组织三种脱蜡方法的比较三种不同脱蜡方法得到的DNA含量有统计学差异(F=5.193,P=0.009)；其中采用二甲苯脱蜡方法均优于另外两种方法,两两比较P值均为小于0.05,水浴加热脱蜡方法同样优于微波脱蜡的方法(P=0.008)。3.不同固定时间对石蜡包埋组织的影响样本组织分别固定1天、3天、7天,提取得到DNA含量呈现明显下降趋势,且差异有统计学意义(F=7.661,P=0.001)；而且三种提取方法DNA提取含量的差异均有统计学意义(P<0.05).而提取方法与固定时间无交互作用(F=2.266,P=0.069)。4.乳腺癌组织与癌旁组织STR分型检出率的比较在本实验中,按所检样本12个及12个以上STR基因座成功分型计成功率。对A组和B组样本均采用二甲苯脱蜡、Chelex-100结合QIAquick(?)PCR Purification Kit纯化法进行DNA提取及STR分型,A组的22例组织中有20例成功分型,而B组中的22例组织均未成功分型。采用矫正的配对卡方检验两组的结果进行统计学分析,得到卡方值为18.05,P值小于0.001,即乳腺癌组织的STR分型检出率高于癌旁组织,差异有显著性意义。5.15个STR基因座在结肠癌组织中的变异观察在研究所用的43例结肠癌与癌旁组织中,发现STR基因座变异的有5例。对两组的结果进行统计学分析,选用似然比检验校正的方法检测,结果显示X2=7.240,P=0.007(双侧),差异显著。结论1.二甲苯脱蜡的效果好于水浴和微波两种加热脱蜡的效果。从提取液中的DNA含量以及操作简易程度上比较,较好的从石蜡包埋组织提取DNA的方法仍然是使用Chelex-100提取结合QIAquick(?)PCR纯化试剂盒纯化法。2.随着固定时间的延长,由甲醛介导的DNA损伤会越来越严重,导致组织DNA的提取以及PCR扩增成功率呈现显著下降的趋势。有效的控制组织的固定时间,可以提高组织DNA提取及扩增的成功率。固定时间为1天内的组织,提取的效果明显好于固定3天和7天的组织。3.乳腺癌组织的STR分型检出率较癌旁组织明显提高。结果显示组织结构对这一结果影响较大,脂肪较少而肿瘤细胞较多的组织可提高检测的成功率。4.对43例结肠癌组织及癌旁组织进行STR检测,发现了5例结肠癌组织在法医常用15个STR基因座中出现了变异的情况。分别分布于D19S433、vWA、 D16S539、D2S1338、D18S51、FGA这6个基因座中。变异类型包括等位基因增加2例,新增等位基因1例,等位基因完全丢失2例。对这一结果用似然比检验校正的方法进行检测,结果显示与癌旁组织相比,结肠癌组织在法医学检验所用的15个STR基因座中出现的变异率是有统计学意义的。因此,在个体识别实际案例中,应尽量选用正常组织进行检测,当条件无法满足,不得不使用肿瘤组织作为检材的时候,遇到某基因座不匹配的情况,必须考虑为肿瘤组织的遗传不稳定性,对观察到的结果慎重作出排除结论。
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